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  Kartierung des Zebrafischgenoms: Strategien und Anwendungen The zebrafish genome: Strategies and applications for physical and radiation hybrid mapping

Otto, G. W. (2002). Kartierung des Zebrafischgenoms: Strategien und Anwendungen The zebrafish genome: Strategies and applications for physical and radiation hybrid mapping. PhD Thesis, Freie Universität Berlin, Berlin, Germany.

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 Creators:
Otto, Georg Wilhelm1, Author
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1Max Planck Society, ou_persistent13              

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Free keywords: zebrafish genome mapping EST STS SNP
 Abstract: Der Zebrafisch ist ein wichtiger Modellorganismus für genetische, molekulare und embryologische Untersuchungen der Embryonalentwicklung. Obwohl immer mehr genomische Ressourcen zur Verfügung stehen (genetische Karten, Bestrahlungshybridkarten, genomische Bibliotheken, cDNA Bibliotheken), ist die Klonierung von Genen, die durch einer Mutante entdeckt wurden, schwierig und zeitaufwendig. Eine physikalische Karte des Genoms, die mit genetischen und Bestrahlungshybridkarten verankert ist, kann die Identifizierung und Klonierung mutierter Gene erleichtern und dient als Grundlage für die Sequenzierung des Genoms. Genkataloge mit Expressions- und Kartierungsdaten sind entscheidend für die Auswahl von Kandidatengenen und ermöglichen daher die Identifizierung mutierter Gene. Das Thema dieser Arbeit ist die Entwicklung und Anwendung der physikalischen Kartierung und Bestrahlungshybridkartierung im Zebrafisch. Die Arbeit gliedert sich in drei Teile: Im ersten Teil wird beschrieben, wie die auf eingestreute repetitive Elemente beruhende Polymerase-Kettenreaktion (IRS-PCR) an das Zebrafischgenom angepaßt und optimiert wurde, insbesondere für die physikalische und Bestrahlungshybridkartierung. Dazu wurden verschiedene repetitive Elemente, Primerbindestellen und PCR Bedingungen getestet. Ein neuer Zebrafischrepeat wurde gefunden und charakterisiert. Eine Markerbank aus IRS-PCR Produkten von fünf Zebrafischstämmen wurde konstruiert, und 27.000 Klone wurden gepickt. Diese Markerbanken wurden durch Oligunukleitid-Fingerprinting normalisiert, wodurch etwa 11.000 verschiedene Sequenzen identifiziert werden konnten. Dadurch wurden auch Produkte mit +/- Polymorphismus in den verschieden Stämmen identifiziert. IRS-PCR Produkte wurden durch Sequenzierung näher charakterisiert. Die Durchschnittsfrequenz von SNPs (single nucleotide polymorphisms) beträgt p = 0.013. Aus diesem Grund ist unsere normalisierte IRS-PCR Markerbank ein geeignetes repräsentatives Subset des Genoms für die SNP-Detektion. Die Kartierung von IRS-PCR Produkten mittels der Hybridisierung auf Bestrahlungshybride wurde ebenfalls entwickelt. Im zweiten Teil wurde eine physikalische Rahmenkarte der Kopplungsgruppe 20 des Zebrafischs erstellt. Ein Kartierungsverfahren wurde entwickelt, in dessen Verlauf kartierte Oligonukleotide auf eine PAC-Bibliothek und IRS-Marker auf YAC- und PAC-Pools hybridisiert wurden. Bis zum jetzigen Zeitpunkt wurden 344 Oligonukleotid- und 284 IRS Sonden verwendet. Insgesamt wurden 3416 PACs getroffen, die zur Zeit durch Restriktions-fingerprinting analysiert werden. Dadurch werden sie in die Tübinger Restriktionskarte integriert und ein Klonpfad für die genomische Sequenzierung wird konstruiert. Ein Teil der Hybridisierungsergebnisse wurde für die Konstruktion von Contigs verwendet. Dies umfaßte 388 Sonden, die 2007 Klone trafen, und damit eine Markerdichte von 1/205 kb repräsentieren. Das Contigassembly besteht aus 249 Contigs, von denen 19% durch mehr als eine Sonde verankert sind. Diese Daten stimmen mit der theoretischen Erwartung überein. Auf diese Weise wurde eine physikalische STS-Rahmenkarte des Chromosoms 20 des Zebrafischs erstellt, die mit den genetischen und Bestrahlungshybridkarten verankert und in die Restriktionsfingerprintkarte integriert ist. Dies ist die erste derartige Karte eines Zebrafischchromosoms. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden Zebrafisch ESTs, die humanen Krankheitsgenen sequenzhomolog sind oder spezifische Expressionsmuster zeigen, auf der Bestahlungshybridkarte positioniert. Bis jetzt wurden > 120 Klone auf diese Weise kartiert. Ziel dieses Teils der Arbeit ist die Identifizierung von Kandidatengenen für Zebrafischmutationen und die verfeinerte Kartierung der Syntänieverhältnisse zwischen Mensch und Zebrafisch. Die Syntäniedaten dienen zur Bestimmung, ob es sich bei homologen Sequenzen von Mensch und Zebrafish um Orthologe oder Paraloge handelt.

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Language(s): eng - English
 Dates: 2002-05-29
 Publication Status: Accepted / In Press
 Pages: -
 Publishing info: Berlin, Germany : Freie Universität Berlin
 Table of Contents: 1 Introduction 1

1.1 Zebrafish as a model organism for studying vertebrate development 2

1.2 Mapping and sequencing of complex genomes 8

1.2.1 Genetic linkage mapping 9

1.2.2 Radiation hybrid mapping 12

1.2.3 Physical mapping 14

1.2.4 Sequencing strategies for complex genomes 17

1.3 High throughput characterisation of the zebrafish transcriptome by gene catalogues and whole mount in situ screens 19

1.4 Cloning of genes identified in mutants 20

1.5 Genome mapping by interspersed repetitive sequence (IRS)-PCR. 21

1.6 Repetitive elements in the zebrafish genome 23

1.7 Physical mapping of zebrafish chromosome 20 26

2 Objective 30

3 Materials and Methods 31

3.1 Materials 31

3.1.1 Laboratory equipment 31

3.1.2 Chemicals and enzymes 32

3.1.3 Oligonucleotides 33

3.1.4 Kits 34

3.1.5 Other materials 34

3.1.6 Nucleic acids 35

3.1.7 E. coli strains, cell lines and zebrafish strains 35

3.1.8 Libraries 36

3.1.9 Buffers and Solutions 36

3.1.10 Culture Media 38

3.2 Methods 39

3.2.1 Isolation of genomic DNA from tissue or adult fish 39

3.2.2 Plasmid preparation 40

3.2.3 Lysis of yeast cells 40

3.2.4 DNA precipitation 41

3.2.5 Restriction digest 41

3.2.6 Dephosphorylation of DNA 5'-ends 41

3.2.7 Ligation of restriction fragments 41

3.2.8 Preparation of E. coli cells for electroporation 42

3.2.9 Transformation 42

3.2.10 Blue/white selection 42

3.2.11 Picking and handling of libraries 42

3.2.12 Spotting of bacterial colonies onto nylon membranes 43

3.2.13 Spotting of DNA onto nylon membranes 43

3.2.14 Capillary blotting of DNA onto nylon membranes ("Southern Blotting") 44

3.2.15 Labelling by random hexamer priming 44

3.2.16 Hybridisation of DNA probes labelled by random priming. 45

3.2.17 Labelling of oligonucleotides by polynucleotide kinase 45

3.2.18 Labelling of "overgo" probes 45

3.2.19 Hybridisation of oligonucleotides 46

3.2.20 Generation of amplified restriction fragments 46

3.2.21 Addition of T-overhangs in cloning vectors 47

3.2.22 Cloning of PCR products using the pAMP10 system 48

3.2.23 IRS-PCR 48

3.2.24 Amplification of plasmid inserts 49

3.2.25 DNA Sequencing 49

3.2.26 Radiation hybrid mapping of ESTs 49

3.2.27 Computational tools and bioinformatics 49

4 Results 51

4.1 IRS-PCR based methods for mapping the zebrafish genome 51

4.1.1 Analysis of the repetitive Mermaid/DANA element. 51

4.1.2 Identification of a new interspersed repetitive element in the zebrafish genome 59

4.1.3 Tests of IRS-PCR Primers 64

4.1.4 Construction of an IRS marker library 66

4.1.5 Characterisation and normalisation of the IRS marker library by oligonucleotide fingerprinting. 67

4.1.6 Characterisation of IRS-PCR products by sequence analysis 73

4.1.7 Radiation hybrid mapping of IRS-PCR products 76

4.1.8 High-density arrays of IRS products of pooled large-insert clones on nylon membranes. 78

4.1.9 Detection of Single Nucleotide polymorphisms in orthologous IRS-PCR products of different zebrafish strains. 83

4.2 Physical mapping of zebrafish linkage group 20 86

4.2.1 Mapping of PACs by hybridisation of oligonucleotides. 87

4.2.2 Mapping of PACs and YACs by hybridisation of IRS-PCR products 90

4.2.3 Assembly of the physical framework map of zebrafish linkage group 20 91

4.3 Radiation hybrid mapping of expressed sequence tags 94

4.4 Genetic mapping using amplified fragment length polymorphism (AFLP) 102

5 Discussion 105

5.1 IRS-based methods for mapping the zebrafish genome 105

5.1.1 Identification and testing of anchor sites for IRS-PCR 105

5.1.2 Size distribution of IRS-PCR products 106

5.1.3 Complexity of the IRS-PCR amplicon 107

5.1.4 Repeat and SNP content 107

5.1.5 IRS-PCR pools for physical mapping 107

5.1.6 Characterisation of a new interspersed repeat 108

5.2 Physical mapping of the zebrafish linkage group 20 109

5.2.1 Mapping strategy 110

5.2.2 Mapping results 110

5.2.3 Significance of the map 112

5.3 Radiation hybrid mapping 113

5.3.1 Mapping of ESTs with specific expression patterns during embryogenesis 113

5.3.2 ESTs homologous to human disease genes 114

5.3.3 Mapping and determination of conserved synteny 115

5.4 Conclusion and outlook 116

6 Summary 119

6.1 Abstract 119

6.2 Zusammenfassung 121

7 Appendix 123

7.1 STS markers used to generate oligonucleotide probes 123

7.2 Oligonucleotide probes for hybridisation on PAC filters 129

7.3 Primers for radiation hybrid mapping 134

7.4 Abbreviations 137

7.5 IUPAC-code of wobble nucleotides 139

7.7 Publications

8 Literature 140
 Rev. Type: -
 Identifiers: eDoc: 29285
 Degree: PhD

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