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Modellsystem Riesenvesikel Integrin alphaIIb beta3; Dissertation; Biophysik; Biochemie;
Abstract:
Within this work, a simplified model system was developed for the experimental investigation of physical mechanisms underlying cell adhesion. Cellular complexity was reduced to three essential components: the lipid bilayer, the cell adhesion molecule integrin and the cytoskeletal protein actin. Integrin was integrated in spherical lipid bilayers, called giant unilamellar vesicles (GUVs), which were additionally filled with actin. Integrin alphaIIb beta3 was purified from human platelet membranes with high yield. Initially, this integrin was reconstituted in small unilamellar vesicles (SUVs). By variation of lipid composition, vesicle size and detergent concentration, crucial parameters for efficient integration could be determined and incorporation efficiency was enhanced. Two different approaches were compared to grow GUVs: electroformation and spontaneous swelling on agarose-lipid films. Besides biochemical characterization, formation of GUVs was investigated by means of confocal laser scanning microscopy confirming successful integration of integrin into the bilayer of the giant vesicles. A novel method for the preparation of GUVs from purified platelet membranes was established. Platelet membranes were directly purified and grown to giant vesicles by electroformation. Interaction of these GUVs with nano-structured and bio-functionalized surfaces was investigated. Adhesion of these integrin-coated vesicles was characterized for the first time by reflection interference contrast microscopy (RICM), which allowed estimation of an average adhesion energy.
Abstract:
In dieser Arbeit wurde ein vereinfachtes Modell zur experimentellen Untersuchung der physikalischen Prozesse, welche der Zelladhäsion zugrunde liegen, entwickelt. Die Komplexität der Zelle wurde reduziert auf drei grundlegende Komponenten: die Lipidmembran, das Zelladhäsionsmolekül Integrin und das Protein Aktin, welches Teil des zellulären Zytoskeletts ist. Integrin wurde in kugelförmige Lipidmembran, sogenannte Riesenvesikel, eingebaut, welche zusätzlich mit Aktin gefüllt waren. Integrin alphaIIb beta3 wurde mit hoher Ausbeute aus Blutplättchenmembranen aufgereinigt. Zunächst wurde dieses Integrin in kleine, einschalige Vesikel rekonstituiert. Durch Variation von Lipidzusammensetzung, Vesikeldurchmesser und Detergenskonzentration konnten grundlegende Parameter für einen effizienten Einbau gefunden, und die Effizienz der Rekonstitution erhöht werden. Zum Wachsen von Riesenvesikeln wurden zwei verschiedene Herangehensweisen verglichen, zum einen Elektroschwellen und zum anderen spontanes Wachstum auf Agarose-Lipidfilmen. Neben der biochemischen Charakterisierung wurde die Bildung von Riesenvesikeln mit einem konfokalen Laserscanning Mikroskop untersucht. Dadurch konnte der erfolgreiche Einbau von Integrin in die Doppelschicht der Riesenvesikel bestätigt werden. Des Weiteren wurde eine neue Methode zur Herstellung von Riesenvesikeln aus Blutplättchenmembranen etabliert. Dies gelingt durch die direkte Aufreinigung von Blutplättchenmembranen und anschließendem Elektroschwellen. Die Wechselwirkung dieser Riesenvesikel mit nanostrukturierten und biofunktionalisierten Oberflächen wurde untersucht. Die Adhäsion dieser mit Integrin bedeckten Vesikel in Abhängigkeit der Ligandendichte wurde erstmals mittels Interferenzreflexionsmikroskopie charakterisiert. Somit konnte eine mittlere Adhäsionsenergie der mit Integrin funktionalisierten Vesikel abgeschätzt werden.
