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Abstract:
Ziel der Arbeit war es, mit Hilfe von microRNA-Ansätzen, unter Ausnutzung der RNA-Interferenz, die Genexpression von Smok1, Tagap1 und Fgd2 gezielt zu verringern. Hierfür sollten microRNA basierte Haarnadelstrukturen gegen Smok1, Tagap1 und Fgd2 kloniert und die Wirkung anschließend in zwei unterschiedlichen in vitro Zellkultursystemen untersucht werden. Analysiert wurden neben den überexprimierten auch die endogenen Formen von Smok1, Tagap1 und Fgd2. Untersuchungen in HEK 293T-Zellen sollten einen möglichen Einfluss der microRNA-Ansätze auf die überexprimierten Komponenten zeigen. Für dieses transientes System wurden Cotransfektion von microRNA-Plasmiden und Überexpressions-vektoren durchgeführt. In den Experimenten zeigte sich, dass eine Verringerung, sowohl der mRNA-Expression, als auch der Proteinexpression, durch Anwesenheit von microRNA-Strukturen möglich ist. Gezeigt werden konnte, die Herunterregulation der mRNA-Expression, sowie eine deutliche Verringerung der Proteinexpression für alle untersuchten Zielgene mit mindestens einem microRNA-Ansatz. Neben diesen Überexpressionsanalysen sollte zusätzlich die Wirkung der microRNA-Ansätze auf die endogenen Formen in embryonalen Stammzellen der Maus untersucht werden. Für dieses System gelang es lediglich die veränderte mRNA-Expression zu analysieren. Im Falle von Fgd2 wurde eine schwache Verringerung der RNA-Expression für zwei Klone festgestellt. Lediglich einer der untersuchten Klone zeigte für endogenes Tagap1 eine Herunterregulation der RNA-Expression. Die Analyse von endogenem Smok1 zeigte dagegen, in fünf von sechs untersuchten ES-Zellklonen, eine deutliche Verringerung des mRNA-Niveaus. Die Herunterregulation der mRNA-Expression entsprach bei Smok1 in etwa den Ergebnissen der HEK-Zelluntersuchungen. Die Ergebnisse beider Systeme sind folglich miteinander vergleichbar, wobei die HEK-Zellexperimente den deutlicheren Effekt zeigten. Das Ziel, der Etablierung von microRNA-Ansätzen zur Genexpressionskontrolle von Smok1, Tagap1 und Fgd2, wurden somit erreicht.
