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Aktin, Rheologie, Mikrofluidik, Plasmamembran, Zellskelett, Mikrorheologie
Abstract:
Seit Jahrzehnten stellt filamentöses Aktin aufgrund seiner bedeutenden Rolle in Hinblick auf Zellmobilität, -integrität und Kraftgenerierung einen wichtigen Gegenstand zellulärer Untersuchungen dar. Als Resultat seiner semiflexiblen Natur zeigen Aktinnetzwerke sowohl viskoses als auch elastisches Verhalten. In vitro Untersuchungen der mechanischen Eigenschaften von Aktin sind aber zumeist auf 3-dimensionale Gele oder Einzelmolekülexperimente beschränkt, obwohl es sich bei den bedeutendsten zellulären Aktintrukturen um 1-dimensionale Bündel, die sogenannten Stressfasern, und um ein 2-dimensionales Netzwerk, den Aktinkortex, handelt. Aus diesem Grund war es Ziel der Arbeit, neuartige Aktin und Aktin-Membran Strukturen innerhalb mikrofluidischer Umgebungen zu erzeugen und ihre viskoelastischen Eigenschaften mittels passiver Einzelpartikel-Mikrorheologie zu untersuchen. Im Vergleich mit 3- und 2-dimensionalen Netzwerken zeigte sich, dass gerichtete Strukturen ein zwischen transversaler und longitudinaler Richtung divergierendes viskoelastisches Verhalten aufweisen, welches sich bei Bündelung mittels Mg2+ Ionen angleicht. Zeitabhängige Untersuchungen des Bündelungsprozesses im Konzentrationsbereich von 5 - 12mM deuten darauf hin, dass die Bündelung auch bei geringeren Mg2+ Konzentrationen auftritt als bislang aus 3-dimensionalen Gelen bekannt ist. Außerdem zeigen sie eine Langzeitstabilität, selbst nach Mg2+ Entfernung aus der Lösung. Darüber hinaus wurde als Modellsystem ein freistehender Aktin-Membran Komplex auf funktionalisierten Lochstrukturen entwickelt, ähnlich dem Aktin-Membran Kortex in Zellen. Mit multiplen Vorteilen gegenüber existierenden Modellsystemen ausgestattet ermöglicht es zukünftige Studien der physikalisch-chemischen Eigenschaften von plasmalemmaverknüpften Aktinnetzwerken.
Abstract:
During the recent decades, filamentous actin has been a target of cellular investigations due to its major role in cell motility, cell shape and force generation. As a result of its semiflexible nature, actin networks show both viscous and elastic behaviour. However, studying the mechanical properties of actin in vitro is typically limited to complex 3-dimensional gels or single molecules, while within cells actin’s major forms are 1-dimensional bundles, the so called stress fibres, and a 2-dimensional network, the so called actin cortex. Thus, this work aims to create novel actin and actin-membrane structures within a microfluidic environment and probe their viscoelastic properties by using particle tracking microrheology, which is based on the thermal motion of single microparticles attached to the filaments. By comparing 3- and 2-dimensional networks with directed actin filaments it was found that linear structures possess a divergent viscoelastic behaviour between the transversal and longitudinal directions, which merges during bundling with Mg2+ ions. Time dependent investigations of the bundling process at Mg2+ concentrations in the 5 - 12mM range indicated that crosslinking may take place at lower concentrations than previously found in 3-dimensional gels and revealed a long term stability of the bundles even after removing Mg2+ from the solution. Furthermore a model system similar to the actinmembrane cortex of cells, a free-standing actin-membrane complex on functionalized holey grids, was developed. This system has several advantages over existing model systems and facilitates future studies of the physical-chemical properties of plasmalemma attached actin networks.
