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  Untersuchungen zur Verwendungder Next Generation Sequenziertechnologiefür die Analyse von Antikörpergenenbei Gesunden und Autoimmunpatienten.

Mollova, S. (2009). Untersuchungen zur Verwendungder Next Generation Sequenziertechnologiefür die Analyse von Antikörpergenenbei Gesunden und Autoimmunpatienten. Diploma Thesis, Technische Universität Braunschweig, Braunschweig.

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Mollova_S_Diplomarbeit_2009.pdf (beliebiger Volltext), 8MB
Name:
Mollova_S_Diplomarbeit_2009.pdf
Beschreibung:
-
OA-Status:
Sichtbarkeit:
Öffentlich
MIME-Typ / Prüfsumme:
application/pdf / [MD5]
Technische Metadaten:
Copyright Datum:
-
Copyright Info:
eDoc_access: PUBLIC
Lizenz:
-

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Urheber

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 Urheber:
Mollova, Svetlana1, Autor
Affiliations:
1Max Planck Society, ou_persistent13              

Inhalt

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Schlagwörter: -
 Zusammenfassung: Antikörper sind Glykoproteine der adaptiven Immunantwort. Ihre Funktion ist die Abwehr von Fremdkörpern, z.B. Krankheitserregern, jedoch führen Störungen des Immunsystems zu Autoimmunerkrankungen. Die Next Generation Sequenziertechnologie ist geeignet, einen schnellen Vergleich zwischen Gesunden und an Rheumatoider Arthritis (RA) leidenden Patienten auf Antikörpergenebene zu ermöglichen. Davor müssen jedoch die experimentellen sowie bioinformatischen Methoden für den Einsatz der Technologie etabliert werden. Im experimentellen Teil dieser Arbeit wurde mittels quantitativer Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) die Basis für den erfolgreichen Testlauf mittels Genome Sequencer FLX Instrument geschaffen. Im bioinformatischen Teil wurde mit Hilfe von Perl-Skripts und einer speziell für die Next Generation Sequenzierdaten programmierten PostgreSQL-Datenbank eine schnelle Analyse von großen Mengen an Next Generation Sequenzierdaten ermöglicht. Somit konnten signifikante Differenzen in der Expression von IgG und IgD mittels qRT-PCR festgestellt werden. Außerdem wurden anhand der Next Generation Sequenzierdaten Unterschiede bezüglich der Antikörperentstehung, -reifung sowie -diversität zwischen Gesunden und RA-Patienten im Hinblick auf die Gennutzung von VH4(DP63) bei IgG und IgD festgestellt. Weitere Untersuchungen sind auf biologischer Ebene notwendig, um die bioinformatisch ermittelten Unterschiede in der Gennutzung zu erforschen und möglicherweise für die therapeutische Anwendung bei RA geeignete Antikörper zu identifizieren.

Details

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Sprache(n): deu - German
 Datum: 2009-11-01
 Publikationsstatus: Angenommen
 Seiten: 109
 Ort, Verlag, Ausgabe: Braunschweig : Technische Universität Braunschweig
 Inhaltsverzeichnis: Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................3
I. Abkürzungen .............................................................................................................3
II. Nukleotidbezeichnungen ....................................................................................................6
1. EINLEITUNG ..............................................................................................................7
1.1. Antikörper: Bildung, Struktur, Funktion ...................................................................7
1.2. Antikörper und ihre Rolle bei Autoimmunerkrankungen ......................................11
1.3. Next Generation Sequenzierung ................................................................................12
1.4. Bioinformatische Analyse von Antikörpergensequenzen ........................................14
1.5. Zielsetzung ...................................................................................................................16
2. MATERIAL .............................................................................................................................17
2.1. Experimenteller Teil .....................................................................................................17
2.1.1. Laborausstattung ....................................................................................................17
2.1.2. Verbrauchsmaterial .................................................................................................17
2.1.3. Chemikalien, Enzyme, Kit-Systeme, Lösungen, Puffer .........................................17
2.1.4. Primer .....................................................................................................................19
2.1.5. RNA- und cDNA-Proben .......................................................................................20
2.1.6. DNA-Längenstandards ...........................................................................................21
2.2. Bioinformatischer Teil .................................................................................................22
2.2.1. Hardware ................................................................................................................22
2.2.2. Software .................................................................................................................22
2.2.3. Internetquellen: Anwendungen und Datenbanken .................................................23
2.2.4. Antikörper-Sequenzen ............................................................................................23
2.2.5. Primer .....................................................................................................................24
3. METHODEN ...........................................................................................................................25
3.1. Experimenteller Teil .....................................................................................................25
3.1.1. DNA-Verdau und Reverse Transkription ...............................................................25
3.1.2. qRT-PCR ................................................................................................................26
3.1.3. Sequenzierungsvorbereitung ..................................................................................31
3.1.4. Polymerase-Kettenreaktion ....................................................................................35
3.1.5. Aufreinigung von PCR-Produkten .........................................................................37
3.1.6. DNA-Gelelektrophorese ........................................................................................38
3.1.7. Überblick der durchgeführten Experimente ...........................................................38
3.2. Bioinformatischer Teil .................................................................................................40
3.2.1. Unterschiedliche Vortests mittels Perl-Programme ...............................................40
3.2.2. Primer-Analysen .....................................................................................................41
3.2.3. VBASE2 „Statistic Analysis“ .................................................................................42
3.2.4. nextIGbase Datenbank ...........................................................................................42
3.2.5. Statistische Auswertung .........................................................................................42
4. ERGEBNISSE .........................................................................................................................43
4.1. Experimentelle Untersuchungen ...............................................................................43
4.1.1. Effizienz-Test und Kreuzreaktivitätstest der qRT-PCR-Primer ............................43
4.1.2. Mengenverhältnis zwischen IgG und IgD bei Gesunden und Patienten ................45
4.1.3. Einsatz von cDNA Pools ........................................................................................46
4.1.4. Ermittlung der cDNA Stoffmenge in den Proben ..................................................47
4.1.5. Vorbereitung der Next Generation Amplicon Sequenzierung ................................48
4.2. Bioinformatische Untersuchungen .............................................................................54
4.2.1. Genauigkeit der Identifizierung von V Genen in gekürzten Sequenzen und
Ermittlung der minimal erforderlichen Read-Länge ..............................................54
4.2.2. V-Gen-Analyse auf Nukleotid-Homopolymeren ...................................................57
4.2.3. Bestimmung der Cut Off Werte in den scFv-Testsequenzen ..................................59
4.2.4. Anzahl der durch Fw-Primer verursachten Mutationen
in den scFv-Testsequenzen .....................................................................................60
4.2.5. V-Gen-Coverage ....................................................................................................61
4.3. Auswertung der Next Generation Sequenzierdaten .................................................66
4.3.1. VBASE2 „Statistic Analysis“ und nextIGbase .......................................................66
4.3.2. Vergleich der Antikörpersequenzen zwischen Gesunden
und Autoimmunpatienten ......................................................................................67
5. DISKUSSION ..........................................................................................................................78
6. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................95
7. DANKSAGUNG .......................................................................................................................96
8. LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................................97
9. ANHANG ..............................................................................................................................102
 Art der Begutachtung: -
 Identifikatoren: eDoc: 456277
 Art des Abschluß: Diplom

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Quelle

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