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Abstract:
Summary
Self-assembly of amphiphilic block copolymers is driven by the chemical
incompatibility of the constituent blocks and can lead to a variety of morphologies, both
in solution and in solid state. The major driving force for the self-assembly of
amphiphilic block copolymers are unspecific hydrophobic interactions. As a result,
control over nanostructure formation is limited, and the structure and properties of the
materials can only be manipulated to a limited extent. For instance, the aggregation
number of micelles cannot be exactly predetermined. In addition, micelles and vesicles
are typically not uniform in size but possess a certain polydispersity.
Synthetic macromolecules generally are heterogeneous with respect to chain length and
composition. Biomacromolecules, such as peptides and proteins, however, are
characterized by a uniform chain length and a precisely defined monomer sequence
(primary structure). These are two important prerequisites that allow the hierarchical
self-organization of linear polypeptide chains into proteins with a precisely defined
three-dimensional structure and exquisite properties. In addition to hydrophobic
interactions, protein folding is also mediated by directed hydrogen-bonding interactions
and electrostatic forces. Unlike synthetic macromolecules, the structure and properties
of proteins are closely related to chain length and primary structure. As a result, the
folding process and protein structure and properties can be precisely controlled at a
molecular level.
In this Thesis, the conjugation of biological structural motifs and synthetic polymers has
been discussed as a versatile strategy to improve control over nanostructure formation
of synthetic polymers. As biological segment, a de novo designed coiled coil forming
peptide sequence was chosen. Coiled coils have been found in more than 200 native
proteins and play an important role in protein stability and are involved in recognition
processes. They consist of 2-5 -helices wrapped around each other to form a
superhelix and are characterized by a heptad repeat sequence and highly specific intra-
and interhelical interactions. Poly(ethylene glycol) (PEG) was selected as the synthetic
polymer segment. Apart from its non-toxicity and non-immunogenicity, which is
required for biomedical applications, PEG is non-ionic, commercially available in many
different molecular weights and known to stabilize peptides and proteins when
covalently attached them.
Peptides were synthesized using solid-phase peptide synthesis and, subsequently, PEG
was attached on-resin. The purified PEG-b-peptide diblock copolymers were
characterized by RP-HPLC, 1H-NMR and MALDI-TOF MS techniques. A library of
PEG-b-peptide diblock copolymers with different peptide and PEG chain length was
synthesized to study the influence of both segment lengths. Circular dichroism and
analytical ultracentifugation experiments indicated that the self-organization properties
of the peptide segments are retained upon conjugation to PEG. In contrast to
conventional amphiphilic block copolymers, which form polydisperse micelles and
vesicles, the PEG-b-peptide diblock copolymers, with a peptide chain length of 23
amino acids and a PEG of molecular weight 750 or 2000, self-organize into discrete,
well-defined supramolecular aggregates. The self-organization of the diblock
copolymers can be described as an equilibrium between unimeric diblock copolymer
molecules and dimeric and tetrameric aggregates, which are held together by
organization of two or four peptide segments into coiled coil superstructures.
In comparison with the pure peptide, conjugation of PEG sterically hampers the
formation of tetrameric aggregates and shifts the equilibrium toward smaller dimeric
aggregates and unimers. Conjugation of PEG, however, results in an increased stability
towards thermal denaturation, presumably via the formation of a PEG shell around the
coiled coil superstructures. A detailed investigation of the three-dimensional structure of
these PEG-b-peptide diblock copolymers, using pulse Eletron Paramagentic Resonance
and Atomic Force Microscopy techniques, indeed showed that the PEG backfolds to the
peptide. In addition, EPR indicated that the peptide helices are aligned in parallel
fashion. AFM confirmed the formation of small grainary structures with a stiff (peptide)
core and a flexible (PEG) shell. The packages have an approximate height of 1 nm and a
diameter of 10 nm. The peptides, in contrast, formed large aggregates.
Directed mutations in the peptide’s primary structure can be used to accurately control
the degree of oligomerization of the PEGylated diblock copolymers and the pH
sensitivity of the resulting aggregates. An anionic and cationic PEG-b-peptide diblock
copolymer showed a pH-dependent coil-to-helix transition at high and low pH,
respectively. An equimolar mixture resulted in the formation of a novel, merely pHinsensitive, de novo designed heteromeric coiled coil. Cytotoxicity studies revealed that
the PEG-b-peptide conjugates are relatively non-toxic and non-hemolytic. The
cytotoxicity of these compounds is strongly related to their self-assembly behavior. The
biocompatibility opens up the pathway for the use of these diblock copolymers in
biomedical applications, such as drug delivery systems. In this respect, it has been
shown here that the cationic homomeric coiled coils can complex DNA. Gene transfer
studies are underway.
The ability to transfer the self-organization properties of specific peptide sequences to
hybrid block copolymers may allow the development of novel macromolecular
materials characterized by unprecedented hierarchical nanoscale order. Accurate control
of structure and organization at the nanometer level is advantageous for many advanced
applications in e.g. optics, electronics and medicine.
In Chapter 6, the structure and supramolecular organization of a de novo designed
metalloprotein, which consists of two N-terminal terpyridine modified coiled coil
protein folding motif sequences held together by an FeII ion, was described. The
organization is not exclusively dictated by metal ion complexation, which is the case in
most of the reported metalloproteins so far, but is the result of the interplay of metal ion
complexation and protein folding. CD and AUC experiments indicated that the folding
properties of the peptide sequences are retained after introduction of the terpyridine
ligand and metal complexation. At low concentration, folding and organization of the
metalloprotein was reminiscent to that of the native coiled coil and dimeric and
tetrameric metalloprotein assemblies were found to exist in equilibrium with unimeric
species. Although this could not be unequivocally proven, there are several indications
which could suggest that, at least part of, the unimeric metalloproteins consist of an
intramolecularly folded coiled coil. At high concentrations, the association behavior of
the metal ion complexes dominates the folding properties and leads to large
supramolecular metalloprotein assemblies.
In Chapter 7, a detailed investigation of the self-assembly of poly(_-benzyl-Lglutamate)-
poly(ethylene glycol)-poly(_-benzyl-L-glutamate) (PBLG-PEG-PBLG) rodcoil-
rod triblock copolymers in the solid state was described. The tandem molecular
interactions present in the triblock copolymers (crystallization, peptide secondary
structure, microphase separation) gave rise to a strongly hierarchical level of
organization: first, the hydrogen bonds present in the peptide blocks stabilize the
peptide secondary structures (-helices and -sheets) and, in addition, chain folding
occurs in PEG; second, the -helical and -sheet secondary structures are packed in
hexagonal and orthogonal unit cells, respectively; and third, the repulsive interactions
between the unlike blocks gave rise to nanostructures typical of phase separated block
copolymers. For low peptide fractions, microphase separation results in PBLG and PEG
phases rich in all secondary structures, however, large undercooling for the PEG
midblock is necessary. Increasing the peptide volume fraction results in interfacial
mixing of the two blocks. Here, only the more coherent peptide secondary structure, i.e.
the -helices, can survive.
Zusammenfassung
Die Selbstorganisation amphiphiler Blockcopolymere wird durch die Inkompatibilität
der individuellen Blöcke angetrieben und kann sowohl in Lösung als auch in Festphase
zu verschiedenen Morphologien führen. Die größte Triebkraft der Selbstorganisation
amphiphiler Blockcopolymere sind unspezifische, hydrophobe Wechselwirkungen. Dies
führt dazu, dass die Bildung von Nanostrukturen nur begrenzt kontrolliert, sowie die
Materialstruktur und Materialeigenschaften nur begrenzt manipuliert werden können.
Beispielsweise ist es nicht möglich, die Aggregationszahl von Mizellen genau
vorherzusagen. Weiterhin sind Mizellen und Vesikel in ihrer Größe nicht uniform,
sondern besitzen eine gewisse Polydispersität.
Im Allgemeinen sind synthetische Makromoleküle in Bezug auf Kettenlänge und
Zusammensetzung heterogen. Im Gegensatz dazu werden Biomakromoleküle, wie z.B.
Peptide und Proteine, durch ihre uniforme Kettenlänge und die genau definierte
Sequenz der Monomerbausteine (Primärstruktur) charakterisiert. Diese Kennzeichen
sind zwei wichtige Voraussetzungen für die hierarchische Selbstorganisation linearer
Polypeptidketten in Proteine mit definierter dreidimensionaler Struktur und
ausgezeichneten Eigenschaften. Neben den hydrophoben Wechselwirkungen wird die
Proteinfaltung durch gerichtete Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatischen
Wechselwirkungen vermittelt. Anders als bei synthetischen Makromolekülen sind
Struktur und Eigenschaften der Proteine eng mit der Kettenlänge und der Primärstruktur
verbunden. Dadurch ist es möglich, sowohl den Faltungsprozess als auch die
Proteinstruktur, und damit die Proteineigenschaften, auf molekularer Ebene genau
kontrollieren zu können.
In dieser Doktorarbeit wurde die Verknüpfung biologischer Struktureinheiten mit
synthetischen Polymeren als vielseitige Strategie zur verbesserten Kontrolle der Bildung
von Nanostrukturen in synthetischen Polymeren diskutiert. Als biologisches Segment
wurde eine neuartige, “Coiled coil“ bildende Peptid-Sequenz entworfen. “Coiled Coil“
wurden bisher in über 200 nativen Proteinen festgestellt und spielen in der
Proteinstabilität und in Erkennungsprozessen ein bedeutende Rolle. Sie bestehen aus
zwei bis fünf -Helices, die sich umeinander wickeln und eine Superhelix bilden, die
durch eine heptamere Wiederholungssequenz sowie hochspezifische intra- und
interhelikale Wechselwirkungen charakterisiert ist. Als synthetisches Polymer Segment
wurde Poly(ethylenglykol) (PEG) ausgewählt. PEG ist ein nichtionisches und
kommerziell in verschiedenen Molekulargewichten erhältliches Polymer. Darüber
hinaus ist PEG nicht toxisch und nicht immunogen, was die wesentlichen
Voraussetzungen für eine biomedizinische Anwendung sind. Weiterhin ist bekannt, dass
PEG Peptide und Proteine stabilisiert, wenn sie kovalent daran gebunden sind.
Die Peptide wurde nach der Methode der Festphasensynthese synthetisiert. Die
Kupplung des PEG erfolgte an das am Harz gebundene Peptid. Die gesäuberten PEG-b-
Peptid Diblockcopolymere wurden mittels RP-HPLC, 1H-NMR und MALDI-TOF MS
Methoden charakterisiert. Um den Einfluss der Kettenlänge nachzuweisen, wurden
Diblockcopolymere mit verschiedenen PEG- und Peptid-Kettenlängen synthetisiert. Mit
Hilfe von Zirkulardichroismus (CD) und analytischer Ultrazentrifugation (AUZ) konnte
gezeigt werden, dass die Eigenschaften der Selbstorganisation des Peptidsegments auch
nach der Konjugation mit PEG erhalten bleiben. Im Gegensatz zu konventionellen
amphiphilen Blockcopolymeren, die polydisperse Mizellen und Vesikel bilden,
organisieren sich PEG-b-Peptid Diblockcopolymere mit einer Peptid Kettenlänge von
23 Aminosäuren und einem PEG-Block mit einem Molekulargewicht von 750 bzw.
2000 in diskrete, genau definierte supramolekulare Aggregate. Die Selbstorganisation
der Diblockcopolymeren kann als ein Gleichgewicht zwischen unimeren
Diblockcopolymermolekülen und dimeren und tetrameren Aggregaten beschrieben
werden, die ihrerseits durch Organisation von zwei oder vier Peptidsegmenten in
“Coiled Coil“ Überstrukturen zusammengehalten werden (Abbildung 8.1).
Im Vergleich zum reinen Peptid behindert die Anknüpfung des PEG sterisch die
Bildung tetramerer Aggregate und verschiebt das Gleichgewicht zugunsten dimerer
Aggregate und Unimeren. Andererseits führt die Anknüpfung von PEG, vermutlich
durch die Bildung einer PEG-Hülle um die “Coiled Coil“, zu einer Erhöhung der
Stabilität gegenüber thermischer Denaturierung. Eine genaue Untersuchung der
dreidimensionalen Struktur der PEG-b-Peptid Diblockcopolymere mittels Pulse
Elektronen-Paramagnetische-Resonanz (EPR) und Atom-Kraft-Mikroskopie (AFM)
ergab in der Tat, dass sich die PEG-Ketten eng um den Peptidkern falten. EPRExperimente
zeigten zudem, dass die Peptid-Helices parallel orientiert sind. AFM
bestätigte die Bildung von diskrete Nanostrukturen mit einem steifen (Peptid) Kern und
einer flexiblen (PEG) Schale. Die Pakete haben eine Höhe von ungefähr 1 nm und
einem Durchmesser von etwa 10 nm. Im Vergleich dazu bildeten die Peptide alleine nur
große, unspezifische Aggregate.
Gezielte Mutationen in der Peptid-Primärstruktur konnten dazu genutzt werden, den
Oligomerisationsgrad der PEGylierten Diblockcopolymere und die pH-Sensitivität der
resultierenden Aggregate genau zu kontrollieren. Anionische und kationische PEG-b-
Peptid Diblcokcopolymere zeigten einen pH-abhängigen Knäuel-Helix-Übergang bei
hohem bzw. niedrigem pH-Wert. Die äquimolare Mischung aus einem anionischen und
einem kationischen Diblockcopolymer führte zu einer neuartigen, aber pHunabhängigen
heteromeren “Coiled Coil“. Zytotoxizitätstudien ergaben, dass die PEGb-
Peptid Konjugate relativ untoxisch und nicht-hemolytisch sind. Ferner konnte gezeigt
werden, dass die Zytotoxizität dieser Verbindungen eng mit dem
Selbstorganisationsverhalten verbunden ist. Die gute Biokompatibilität eröffnet den
Weg für die Anwendung dieser Diblockcopolymere in biomedizinischen Applikationen,
wie z.B. drug delivery Systeme. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass die
kationischen homomeren “Coiled Coil“ in der Lage sind DNA zu komplexieren.
Gentransferexperimente sind in Arbeit.
Die Fähigkeit, die Eigenschaften der Selbstorganisation von spezifischen
Peptidsequenzen auf Hybrid-Blockcopolymere zu übertragen, ermöglicht die
Entwicklung neuartiger polymerer Materialen, die durch eine bisher nicht erreichte
Ordnung auf nanoskopischer Ebene gekennzeichnet sind. Die genaue Kontrolle von
molekularer Struktur und Organisation bietet Vorteile bei der Entwicklung neuer
Anwendungen im Bereich Optik, Elektronik oder Medizin.
In Kapitel 6 wurde die Struktur und Selbstorganisation eines neuartig entwickelten
Metalloproteins beschrieben, welches aus zwei N-terminal Terpyridin-modifizierten
“Coiled coil“ besteht, die durch ein FeII-Ion zusammengehalten werden. Die Struktur
wird nicht, wie im Fall der bisher beschriebenen Metalloproteinen, ausschließlich durch
die Metallionkomplexierung bestimmt, sondern ist das Resultat des Wechselspiels
zwischen Metallionkomplexierung und Proteinfaltung. Wie CD- und AUZ-Experimente
zeigten, bleiben die Faltungseigenschaften der Peptidsequenzen auch nach der
Einführung der Terpyridinliganden und Metallkomplexierung erhalten. Bei niedrigen
Konzentrationen waren Faltung und Organisation der Metalloproteine vergleichbar mit
dem Verhalten der ursprünglichen “Coiled coil“ und es wurden sowohl dimere als auch
tetramere Metalloprotein-Aggregate im Gleichgewicht mit ihren unimeren Spezies
gefunden (Abbildung 8.2).
Obwohl dies nicht eindeutig nachgewiesen werden konnte, gibt es einige Hinweise, die
darauf hindeuten, dass zumindest ein Teil der unimeren Metalloproteine aus
intramolekular gefalteten “Coiled coil“ bestehen. Bei hohen Konzentrationen dominiert
jedoch das Assoziationsverhalten des Metallion-Komplexes die Faltungseigenschaften
und führt zu großen, supramolekularen Metalloprotein-Aggregaten.
In Kapitel 7 wurde eine detaillierte Untersuchung der Selbstorganisation von Poly(-
Benzyl-L-Glutamate)-Poly(Ethylen Glykol)-Poly(-Benzyl-L-Glutamate) (PBLG-PEGPBLG)
Stäbchen-Knäuel-Stäbchen Triblockcopolymeren in fester Phase beschrieben.
Die aneinander gekoppelten molekularen Wechselwirkungen, die in einem
Triblockcopolymer vorhanden sind (Kristallisation, Sekundärstruktur der Peptide und
Mikrophasenseparation), haben einen festen hierarchischen Ablauf der Organisation zur
Folge: 1.) die im Peptidblock enthaltenen Wasserstoffbrückenbindungen stabilisieren
die Sekundärstruktur des Peptides (-Helix, -Faltblatt) und darüber hinaus tritt eine
Faltung der PEG-Kette auf; 2.) die -helikale und -Faltblatt Peptid-Sekundärstrukturen
packen sich in hexagonalen respektive orthogonalen Einheitszellen; 3.) die abstoßenden
Wechselwirkungen zwischen den unterschiedlichen Blöcken führen zu für
phasenseparierte Blockcopolymere typischen Nanostrukturen. Bei kleineren
Peptidanteilen hat die Mikrophasenseparation zur Folge, dass die PBLG- und PEGPhasen
alle Sekundärstrukturen enthalten. Allerdings ist hierfür eine starke Abkühlung,
die nur Einfluss auf den mittleren PEG-Block hat, notwendig. Eine Erhöhung des
Peptid-Volumenanteils führt zu einer Vermischung der Blöcke an der Grenzschicht. In
diesem Fall existiert nur die kohärentere Peptid-Sekundärstruktur - die -Helix – weiter.
