hide
Free keywords:
-
Abstract:
In der vorliegenden Arbeit wurde die gerichtete Evolution zur Verbesserung der Enantioselektivität der CHMO in der Baeyer-Villiger-Oxidation von 4-Hydroxycyclohexanon eingesetzt (Abb. 64). Der CHMO-Wildtyp katalysiert die Umsetzung mit einer Enantioselektivität von 9 % ee zugunsten von (R)-5-(2-hydroxyethyl)-dihydrofuran-2-on. In der ersten Generation wurden etwa 10.000 Mutanten durch epPCR generiert und auf die Umsetzung mit 4-Hydroxycyclohexanon getestet. Die höchste (R)-selektive Mutante I-E1-F1 zeigt einen ee von 55% und die beste (S)-selektive Mutante weist sogar einen ee von 83 % auf. In der zweiten Generation konnte die (R)-Selektivität noch auf 90 % gesteigert werden (Mutante II-D19-E6). Die Untersuchung der Einzelmutanten von II-D19-E6 zeigt deutlich die Relevanz der Position 146.
Einige verbesserte Mutanten (Hits) aus dem Screening mit 4-Hydroxycyclohexanon wurden auf die Enantioselektivität in der Baeyer-Villiger-Oxidation von 4-Methoxycyclohexanon hin getestet. Der Wildtyp-CHMO setzt das 4-Methoxycyclohexanon mit einem ee von 78 % zugunsten des (S)-Enantiomers um. Aus dem Screening mit den Hits gingen mehrere verbesserte (S)-selektive Mutanten hervor, wobei die beste Mutante (I-K2-F5; F432S) einen ee von 98.6 % zeigt. Genau diese Mutante zeigt auch schon bei der Umsetzung von 4-Hydroxycylohexanon einen ee-Wert von 80 % zugunsten des (S)-Enantiomers. Eine (R)- selektive Mutante für dieses Substrat wurde nicht gefunden.
Die Mutante I-K2-F5 wurde in anderen Arbeitskreisen getestet, wobei eine breite Substratakzeptanz nachgewiesen wurde.
Die Sättigungsbank der Position 432 zeigt, dass über die Art der vorliegenden Aminosäure die Richtung der Selektivität gesteuert werden kann. So führt beispielsweise die Einührung eines Serins oder Threonins an der Position 432 zu hohen (S)-Selektivitäten und die Einführung eines Asparagins oder Prolins zu hohen (R)-Selektivitäten.
Höchst interessant für die Fortsetzung der gerichteten Evolution ist die Mutante I-SAT2-4-D11 (F432G, P320L; 72 % (R)-selektiv). Sie besitzt im Vergleich zu I-SAT2-1-C8 (F432G, 17 % (S)-selektiv) eine zusätzliche Mutation an der Position 320, was zu einer hohen (R)-Selektivität führt. Eine Sättigung dieser Position könnte eine noch bessere Mutante hervorbringen, welche dann auf dem weiteren Weg der gerichteten Evolution einem Shuffling mit anderen hoch (R)-selektiven Mutanten unterzogen werden kann.
Mit den aus dieser Arbeit gesammelten Daten können Struktur- Wirkungszusammenhänge modelliert werden. Eine Kristallstruktur der CHMO steht allerdings noch aus. Es kann aber ein Homologiemodell mit der erst kürzlich erhaltenen Kristallstruktur der Phenylacetonmonooxygenase[159] aufgestellt werden. Damit ist ein Verständnis der Selektivität des Enzyms in greifbare Nähe gerückt und der Weg für ein rationales Design, mit den durch gerichtete Evolution gewonnen Erkenntnissen, bereitet.
