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  Identifizierung funktioneller Intrabodies für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in SCA2.

Weber, S. (in preparation). Identifizierung funktioneller Intrabodies für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in SCA2.

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Item Permalink: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-7D9A-E Version Permalink: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-7D9B-C
Genre: Thesis

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:
Weber_S_Bachelorarbeit_2009.pdf (Any fulltext), 4MB
Name:
Weber_S_Bachelorarbeit_2009.pdf
Description:
-
Visibility:
Public
MIME-Type / Checksum:
application/pdf / [MD5]
Technical Metadata:
Copyright Date:
-
Copyright Info:
eDoc_access: PUBLIC
License:
-

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 Creators:
Weber, Susanne1, Author              
Affiliations:
1Dept. of Vertebrate Genomics (Head: Hans Lehrach), Max Planck Institute for Molecular Genetics, Max Planck Society, ou_1433550              

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Free keywords: -
 Abstract: Die Spinozerebellare Ataxie Typ 2 ist eine neurodegenerative Erkrankung, die autosomal dominant vererbt wird. Sie gehört zur Familie der Polyglutaminerkrankungen, welche durch die Expansion von CAG-Wiederholungen in den krankheitsauslösenden Genen gekennzeichnet ist. Das SCA2 auslösende Gen kodiert für das Protein Ataxin-2, dessen biologische Funktion noch nicht vollständig verstanden ist. Die Mechanismen der Erkrankung konnten ebenfalls noch nicht geklärt werden. Für die Aufklärung der Funktion von Proteinen, sowie von Erkrankungsmechanismen besitzen intrazellulär exprimierte scFv-Fragmente, so genannte “Intrabodies”, ein hohes Potential. Daher war es Ziel dieser Arbeit im neuartigen “Intrabody” Screen Antikörperfragmente zu identifizieren, die die Interaktion verschiedener Regionen des Ataxin-2 Proteins mit PABC bzw. SH3GL3 unterbinden. Für die Interaktion von ATXN2(Q22)1-396 und SH3GL3, sowie ATXN2481-815 und SH3GL3 konnten im Rahmen der Arbeit potentiell inhibitorische Binder gefunden werden, für die Interaktion von ATXN2816-1312 und PABC hingegen nicht. Die Antikörperfragmente, die für den “Intrabody” Screen eingesetzt wurden, stammten aus Phagen-Display-Selektionsrunden gegen ATXN2816-1312 und SH3GL3. Aus diesen und weiteren Selektionsrunden wurden parallel monoklonale scFv-Fragmente für ATXN2816-1312, SH3GL3 und eGFP hergestellt. Diese wurden in ELISA und Western Immunoblot auf ihre Antigenbindung untersucht. Im ELISA konnten für alle Targets Binder identifiziert werden. Die Antigenbindung der scFv-Fragmente war im Western Immunoblot jedoch nicht nachweisbar. Die Expression und Kolokalisation der anti-ATXN2816-1312 scFv-Fragmente mit Ataxin-2 wurde im Anschluss in Säugerzelllinien untersucht. Als Kontrolle dienten im ELISA identifizierte anti-eGFP-Binder. Alle scFv-Fragmente ließen sich in den Säugerzellen exprimieren. Eine mögliche Interaktion der anti-ATXN2816-1312“Intrabodies” mit endogenem Ataxin-2 konnte jedoch anhand der mikroskopischen Aufnahmen weder eindeutig bestimmt, noch ausgeschlossen werden.

Details

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Language(s): deu - German
 Dates: 2009-05-01
 Publication Status: Not specified
 Pages: 79
 Publishing info: Braunschweig : Technische Universität Braunschweig
 Table of Contents: Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................
1. Einleitung ......................................................... 1
1.1 Spinozerebellare Ataxie Typ 2 ......................................................... 1
1.2 Ataxin-2 ......................................................... 2
1.3 Antikörper-Phagen-Display ......................................................... 3
1.4 Antikörper, Antikörperfragmente und “Intrabodies” ....................................................... ..5
1.5 “Yeast two-Hybrid” und “Intrabody” Screen ......................................................... 7
1.6 Tomlinson Bibliothek I ......................................................... 8
1.7 Zielsetzung.............................................. 9
2. Material und Methoden

2.1 Material ......................................................... 11
2.1.1 Laborgeräte und Zubehör ......................................................... 11
2.1.2 Verbrauchsmaterialien ......................................................... 12
2.1.3 Lösungen, Puffer und Chemikalien ......................................................... 13
2.1.4 Medien und Zusätze ......................................................... 16
2.1.5 Mikroorganismen und Säugetierzelllinien ......................................................... 18
2.1.6 Plasmide und Phagmide ......................................................... 19
2.1.7 Primer ......................................................... 19
2.1.8 Enzyme ......................................................... 20
2.1.9 Antikörper und Nachweisreagentien ......................................................... 20
2.1.10 DNA- und Proteinstandards ......................................................... 20
2.1.11 Kitsysteme ......................................................... 21
2.1.12 Software und Webtools ......................................................... 21
2.1.13 Sonstiges ......................................................... 21
2.2 Mikrobiologische Methoden ......................................................... 22
2.2.1 Herstellung von Medien für die E. coli Kultivierung ......................................................... 22
2.2.2 Kultivierung von Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae) ..........................................................22
2.2.3 Bestimmung der Zelldichte von Bakterien- und Hefekulturen ................................ ............22
2.2.4 Lagerung und Reaktivierung von Bakterien- und Hefekulturen .............................. ..............22
2.2.5 Infektion von E. coli mit scFv-Antikörperfragment tragenden Phagen ........................................ 22
2.2.6 Transformation von E. coli mittels Elektroporation ................................................ .........23
2.2.7 Transformation von S. cerevisiae und “Intrabody” Screen ..................................... .............23

2.2.8 Proteinexpression ......................................................... 25
2.2.8.1 scFv-Expression in Mikrotiterplatten ......................................................... 25
2.2.8.2 Antigenexpression ......................................................... 25
2.3 Molekularbiologische Methoden ......................................................... 25
2.3.1 Agarose-Gelelektrophorese ......................................................... 25
2.3.2 Extraktion von DNA aus Agarosegelen ......................................................... 26
2.3.3 Plasmidpräparation ......................................................... 26
2.3.4 Bestimmung der DNA-Konzentration ......................................................... 26
2.3.5 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA ......................................................... 26
2.3.6 Ligation von DNA-Fragmenten ......................................................... 27
2.3.7 Ethanolpräzipitation ......................................................... 28
2.3.8 Sequenzierung ......................................................... 28
2.3.9 Polymerase Ketten Reaktion ......................................................... 28
2.4 Proteinbiochemische Methoden ......................................................... 29
2.4.1 Aufreinigung von Proteinen (Antigenen) mit His6-“Tag” ...................................... ...................29
2.4.2 Bestimmung der Antigenkonzentrationen ......................................................... 30
2.4.3 scFv-Präparation in Mikrotiterplatten ......................................................... 30
2.4.4 “Enzyme-linked Immunosorbent Assay” mit scFv-Fragmenten ......................................... 30
2.4.5 SDS-PAGE ......................................................... 31
2.4.6 Coomassie-Färbung und Entfärbung ......................................................... 31
2.4.7 Western Immunoblot ......................................................... 31
2.4.8 Färbung mit Streptavidin-HRP ......................................................... 32
2.4.9 Bestimmung der Proteinstabilität ......................................................... 32
2.5 Zellbiologische Methoden ......................................................... 33
2.5.1 Kultivierung von Säugetierzellen ......................................................... 33
2.5.2 Transfektion von Säugetierzellen ......................................................... 33
2.5.3 Induktion von oxidativem Stress in Säugetierzellen ......................................................... 33
2.5.4 Immunfluoreszenzfärbung und -mikroskopie ..........................................................33
3. Ergebnisse ......................................................... 35
3.1 in vivo Identifikation von inhibitorischen scFv-Antikörperfragmenten mittels “Intrabody” Screen ......................................................... 35
3.1.1 Subklonierung einzelner Selektionsrunden in einen Hefeexpressionsvektor .......... .........................35
3.1.2 “Intrabody” Screen ......................................................... 37
3.2 in vitro Identifizierung monoklonaler Binder (scFv-Fragmente) ................................... .....42

3.2.1 Antigengewinnung für ELISA und Western Immunoblot ....................................... ..................42
3.2.2 Gewinnung von monoklonalen scFv-Fragmenten für ELISA und Western Immunoblot ..................... .............44
3.2.3 ELISA zur Identifizierung monoklonaler Binder .................................................... .....44
3.2.4 Western Immunoblot ausgewählter monoklonaler Binder ...................................... ...................47
3.2.5 DNA-Sequenzierung ausgewählter monoklonaler Binder .48
3.3 in vivo Expressionsstudien ausgewählter scFv-Fragmente in Säugetierzellen ............... .......................50
3.3.1 Subklonierung von Antikörperfragmenten in einen Expressionsvektor für Säugetierzellen ................... 50
3.3.2 Expression von “Intrabodies” in Säugerzellen ......................................................... 53
4. Diskussion ......................................................... 58
4.1 in vivo Selektion von scFv-Fragmenten ......................................................... 58
4.2 in vivo Identifikation inhibitorischer scFv-Antikörperfragmente ................................ 59
4.3 in vitro Identifizierung von monoklonalen antigenbindenden scFv-Fragmenten .......... ..............62
4.4 in vivo Expressionsstudien ausgewählter scFv-Fragmente in Säugerzellen ................... ......................64
4.5 Fazit ......................................................... 65
5. Zusammenfassung ......................................................... 66
6. Literaturverzeichnis ......................................................... 67
Eidesstattliche Erklärung
Danksagung
 Rev. Method: -
 Identifiers: eDoc: 456296
 Degree: Bachelor

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