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Language(s):
deu - German
Dates:
2009-05-01
Publication Status:
Not specified
Pages:
79
Publishing info:
Braunschweig : Technische Universität Braunschweig
Table of Contents:
Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................
1. Einleitung ......................................................... 1
1.1 Spinozerebellare Ataxie Typ 2 ......................................................... 1
1.2 Ataxin-2 ......................................................... 2
1.3 Antikörper-Phagen-Display ......................................................... 3
1.4 Antikörper, Antikörperfragmente und “Intrabodies” ....................................................... ..5
1.5 “Yeast two-Hybrid” und “Intrabody” Screen ......................................................... 7
1.6 Tomlinson Bibliothek I ......................................................... 8
1.7 Zielsetzung.............................................. 9
2. Material und Methoden
2.1 Material ......................................................... 11
2.1.1 Laborgeräte und Zubehör ......................................................... 11
2.1.2 Verbrauchsmaterialien ......................................................... 12
2.1.3 Lösungen, Puffer und Chemikalien ......................................................... 13
2.1.4 Medien und Zusätze ......................................................... 16
2.1.5 Mikroorganismen und Säugetierzelllinien ......................................................... 18
2.1.6 Plasmide und Phagmide ......................................................... 19
2.1.7 Primer ......................................................... 19
2.1.8 Enzyme ......................................................... 20
2.1.9 Antikörper und Nachweisreagentien ......................................................... 20
2.1.10 DNA- und Proteinstandards ......................................................... 20
2.1.11 Kitsysteme ......................................................... 21
2.1.12 Software und Webtools ......................................................... 21
2.1.13 Sonstiges ......................................................... 21
2.2 Mikrobiologische Methoden ......................................................... 22
2.2.1 Herstellung von Medien für die E. coli Kultivierung ......................................................... 22
2.2.2 Kultivierung von Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae) ..........................................................22
2.2.3 Bestimmung der Zelldichte von Bakterien- und Hefekulturen ................................ ............22
2.2.4 Lagerung und Reaktivierung von Bakterien- und Hefekulturen .............................. ..............22
2.2.5 Infektion von E. coli mit scFv-Antikörperfragment tragenden Phagen ........................................ 22
2.2.6 Transformation von E. coli mittels Elektroporation ................................................ .........23
2.2.7 Transformation von S. cerevisiae und “Intrabody” Screen ..................................... .............23
2.2.8 Proteinexpression ......................................................... 25
2.2.8.1 scFv-Expression in Mikrotiterplatten ......................................................... 25
2.2.8.2 Antigenexpression ......................................................... 25
2.3 Molekularbiologische Methoden ......................................................... 25
2.3.1 Agarose-Gelelektrophorese ......................................................... 25
2.3.2 Extraktion von DNA aus Agarosegelen ......................................................... 26
2.3.3 Plasmidpräparation ......................................................... 26
2.3.4 Bestimmung der DNA-Konzentration ......................................................... 26
2.3.5 Restriktionsverdau von Plasmid-DNA ......................................................... 26
2.3.6 Ligation von DNA-Fragmenten ......................................................... 27
2.3.7 Ethanolpräzipitation ......................................................... 28
2.3.8 Sequenzierung ......................................................... 28
2.3.9 Polymerase Ketten Reaktion ......................................................... 28
2.4 Proteinbiochemische Methoden ......................................................... 29
2.4.1 Aufreinigung von Proteinen (Antigenen) mit His6-“Tag” ...................................... ...................29
2.4.2 Bestimmung der Antigenkonzentrationen ......................................................... 30
2.4.3 scFv-Präparation in Mikrotiterplatten ......................................................... 30
2.4.4 “Enzyme-linked Immunosorbent Assay” mit scFv-Fragmenten ......................................... 30
2.4.5 SDS-PAGE ......................................................... 31
2.4.6 Coomassie-Färbung und Entfärbung ......................................................... 31
2.4.7 Western Immunoblot ......................................................... 31
2.4.8 Färbung mit Streptavidin-HRP ......................................................... 32
2.4.9 Bestimmung der Proteinstabilität ......................................................... 32
2.5 Zellbiologische Methoden ......................................................... 33
2.5.1 Kultivierung von Säugetierzellen ......................................................... 33
2.5.2 Transfektion von Säugetierzellen ......................................................... 33
2.5.3 Induktion von oxidativem Stress in Säugetierzellen ......................................................... 33
2.5.4 Immunfluoreszenzfärbung und -mikroskopie ..........................................................33
3. Ergebnisse ......................................................... 35
3.1 in vivo Identifikation von inhibitorischen scFv-Antikörperfragmenten mittels “Intrabody” Screen ......................................................... 35
3.1.1 Subklonierung einzelner Selektionsrunden in einen Hefeexpressionsvektor .......... .........................35
3.1.2 “Intrabody” Screen ......................................................... 37
3.2 in vitro Identifizierung monoklonaler Binder (scFv-Fragmente) ................................... .....42
3.2.1 Antigengewinnung für ELISA und Western Immunoblot ....................................... ..................42
3.2.2 Gewinnung von monoklonalen scFv-Fragmenten für ELISA und Western Immunoblot ..................... .............44
3.2.3 ELISA zur Identifizierung monoklonaler Binder .................................................... .....44
3.2.4 Western Immunoblot ausgewählter monoklonaler Binder ...................................... ...................47
3.2.5 DNA-Sequenzierung ausgewählter monoklonaler Binder .48
3.3 in vivo Expressionsstudien ausgewählter scFv-Fragmente in Säugetierzellen ............... .......................50
3.3.1 Subklonierung von Antikörperfragmenten in einen Expressionsvektor für Säugetierzellen ................... 50
3.3.2 Expression von “Intrabodies” in Säugerzellen ......................................................... 53
4. Diskussion ......................................................... 58
4.1 in vivo Selektion von scFv-Fragmenten ......................................................... 58
4.2 in vivo Identifikation inhibitorischer scFv-Antikörperfragmente ................................ 59
4.3 in vitro Identifizierung von monoklonalen antigenbindenden scFv-Fragmenten .......... ..............62
4.4 in vivo Expressionsstudien ausgewählter scFv-Fragmente in Säugerzellen ................... ......................64
4.5 Fazit ......................................................... 65
5. Zusammenfassung ......................................................... 66
6. Literaturverzeichnis ......................................................... 67
Eidesstattliche Erklärung
Danksagung
Rev. Type:
-
Identifiers:
eDoc: 456296
Degree:
Bachelor
