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  Detektion einzelsträngiger DNA mit der Hilfe von DNAzymen

Hasselbach, D. (2008). Detektion einzelsträngiger DNA mit der Hilfe von DNAzymen. Bachelor Thesis, Universität Potsdam, Potsdam.

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Item Permalink: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-7F42-D Version Permalink: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-7F43-B
Genre: Thesis

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Hasselbach.pdf (Any fulltext), 2MB
Name:
Hasselbach.pdf
Description:
-
Visibility:
Public
MIME-Type / Checksum:
application/pdf / [MD5]
Technical Metadata:
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-
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eDoc_access: PUBLIC
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-

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 Creators:
Hasselbach, David1, Author
Affiliations:
1Max Planck Society, ou_persistent13              

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 Abstract: In dieser Arbeit wurde eine katalytisch aktive einzelsträngige DNA (DNAzym), welche durch Bindung des Porphyrins Hemin eine Peroxidaseaktivität zeigt, auf ihre Anwendbarkeit für die Detektion ober ächengekoppelter einzelsträngiger Nukleinsäuren überprüft. Ein an eine Ober äche gekoppeltes DNA-Oligonukleotid sollte als Analyt dienen. In einem auf der rolling circle ampli cation (RCA) basierenden Assay sollte der Analyt kovalent mit einer Vielzahl an DNAzymen markiert werden und nach einer photometrischen bzw. luminometrischen Reaktion detektiert werden. Für die Etablierung des Assays wurden zuerst die Eigenschaften des DNAzyms untersucht. Zur Bestimmung der Aktivität des DNAzyms wurde der Umsatz von ABTS und Luminol mit H2O2 gemessen. Dabei ergaben beide Pu er die gleiche Sensitivität. Die Luminolmessung hatte einen stark eingschränkten Messbereich (1-50nM DNAzym), weshalb hauptsächlich mit dem ABTS als Substrat gearbeitet wurde. Mit dem Umsatz von ABTS konnten DNAzym-Konzentrationen von 1-1000nM detektiert werden konnten. Durch Aufnahme einer Michaelis-Menten-Kinetik wurde die Wechselzahl bezogen auf den ABTS-Umsatz von 0,631s bestimmt. Die Bindung des Hemins an das DNAzym wurde untersucht und die Dissoziationskonstante mit KD = 0; 58 0; 31 M (T=298K) bestimmt. Es wurde gezeigt, dass der Abstand zwischen zwei DNAzymen auf einem Strang mindestens 25 Nukleotide betragen sollte, damit sich beide ausbilden. Ein nicht immobilisierter Analyt sollte mit dem gewünschten Assay detektiert werden. Dies gelang mit nanomolaren Konzentrationen des Analyten. Dabei erhielt man einen stetigen Anstieg der Peroxidaseaktivität des DNAzyms bis zu einer RCA-Dauer von 40min. Eine Detektion eines an eine Ober äche gekoppelten Analyten war bisher nicht möglich. Eine Bindung und eine RCA-Reaktion an der Ober äche konnte zumindest in geringem Maÿe nachgewiesen werden, die Peroxidaseaktivität der entstandenen DNAzym-Sequenzen jedoch nicht.

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Language(s): deu - German
 Dates: 2008-08-19
 Publication Status: Accepted / In Press
 Pages: 35
 Publishing info: Potsdam : Universität Potsdam
 Table of Contents: 1 Zusammenfassung 1
2 Einleitung 2
2.1 DNAzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
2.2 Rolling circle ampli cation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2.3 Zielstellung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
3 Materialien und Methoden 6
3.1 Materialien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.1.1 Oligonukleotide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.1.2 Pu er . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
3.2 Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
3.2.1 Ausbildung der DNAzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
3.2.2 Luminometrische Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
3.2.3 Photometrische Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.2.4 Standardisierung der Messsignale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.2.5 Untersuchung der Heminbindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
3.2.6 Herstellung der RCA-Matrize . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.2.7 RCA in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.2.8 Ober ächenbehandlungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.2.9 Immobilisierung der DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
3.2.10 Konformation und Messung an der Ober äche . . . . . . . . . . . . . . . . 12
4 Ergebnisse 13
4.1 DNAzyme in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4.1.1 Standardisierung der Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4.1.2 Optimierung der Messpu er . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4.1.3 Untersuchung des Hintergrundsignals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.1.4 Heminbindung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
4.1.5 Untersuchung der Konformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
4.1.6 Untersuchung der Sensitivität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
4.1.7 Optimierung des Abstands zwischen benachbarten DNAzymen . . . . . . 17
4.2 RCA in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.2.1 Kontrollen der RCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.2.2 Optimierung der RCA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
4.3 Immobilisierte DNAzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
4.4 RCA-Assay an der Ober äche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
5 Diskussion 23
5.1 Ausleseprinzipien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
5.2 Eigenschaften des verwendeten DNAzyms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
5.3 RCA in Lösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
5.4 Ober ächenkopplung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
5.5 DNAzym-Aktivität an der Ober äche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
5.6 RCA-Assay an der Ober äche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
5.7 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Literaturverzeichnis 27
 Rev. Method: -
 Identifiers: eDoc: 444392
 Degree: Bachelor

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