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Ribosome; Protein synthesis; Antibiotics; Cell-free expression systems
Abstract:
Parameter zweier in vitro Systeme zur Proteinsynthese wurden analysiert und verbessert, die optimierten Systeme wurden zum Studium ausgesuchter Antibiotika und Aufklärung ihrer Hemmechanismen angewendet. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Optimierung eines gekoppelten Transkriptions-Translations-Systems (Rapid Translation System, Roche). Mit GFP als Reporter konnten große Mengen synthetisiert werden (bis zu 4 mg/ml), jedoch mit unbefriedigender Aktivität (ca. 50%). Ein Grund könnte die weit verbreitete T7 RNA Polymerase sein, deren Transkriptionsrate bis zu achtmal schneller ist als die der E. coli Transkriptase und damit die Kopplung von Transkription und Translation aufhebt. Tatsächlich wurde die aktive Fraktion erheblich angehoben, wenn entweder eine genetisch manipulierte, langsamere T7 Polymerase eingesetzt wurde oder die Inkubationstemperatur auf 20 °C erniedrigt wurde. Eine Abnahme der Proteinsynthese nach siebenstündiger Inkubation wurde nicht durch einen Mangel an Triphosphaten, sondern einen Mangel an Aminosäuren verursacht. Ein zweite Aminosäuregabe nach 7 Stunden bei 20°C führte zur Synthese von etwa 4 mg/ml bei praktisch voller GFP Aktivität. 2. Das RTS wurde zu einem System für umfassende Analyse der Proteinsynthese-Genauigkeit modifiziert. Es wurden unter anderen Edein und Pactamycin analysiert. Das Edein, aber nicht Pactamycin entpuppte sich als starker Induktor von Fehleinbau. Einen überraschenden Befund gab es bei NRI: Es verursacht hohe Fehlereinbau, jedoch nicht im Standard poly(U) System (Leu gegenüber Phe Einbau), was eine Grenze des poly(U) Systems aufzeigt. 3. Wir entwickelten unser Standard poly(U) System zu einem robusten Instrument und erzielten statistisch 100 bis 300 eingebaute Phe Reste per Ribosom. Es hat folgende Merkmale: (i) 4.5 mM Mg2+ erscheint optimal gemessen an Synthese- und Fehleinbaurate. (ii) Hoher Phe-Einbau erlaubt eine genaue Messung der Fehlerrate mit einer Auflösungsgrenze von 1:10.000 (ein Fehleinbau per 10.000 eingebauten Phe). Das System weist einen Fehlereinbau von 1:2.000 auf, was der in vivo Genauigkeit entspricht. (iii) Ein Fehleinbau bezüglich der „wobble“ Position des Codons (dritte Nukleotidposition) häufig, einen bezüglich des mittleren Nucleotids des A-Codons wird nicht beobachtet, auch wenn der Fehleinbau dramatisch von Streptomycin oder angehobener Mg2+ Konzentration verstärkt wird; wohl aber ein sehr geringer Fehleinbau bezüglich der ersten Position. 4. Kasugamycin: Der Hemmechanismus wurde aufgeklärt und zusammen mit kristallographischen Untersuchungen der Bindeort bestimmt: Das Antibiotikum hemmt die Bindung der P-tRNA nur in der 30S Untereinheit (jedoch nicht am 70S Ribosom), durch Störung der Codon-Anticodon Wechselwirkung nahe auf der Seite der E-Stelle. Unsere Daten erklären, warum die 70S Initiation von „leaderless“ mRNA nicht von Kasugamycin gestört wird. 5. Widersprechende Daten zu Aminoglycosid-Effekten auf die A-Stellen Besetzung wurden aufgelöst. Wir zeigten, dass unter artifiziellen Bedingungen Aminoglykoside eine Rück-Translokation auslösen (in Übereinstimmung mit jüngst publizierte Daten einer anderen Gruppe), aber auch dass dieser Effekt keinen Bedeutung für den Hemmechanismus hat und den bakteriziden Effekt dieser wichtigen Antibiotikagruppe erklären könnte.
