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  Expressionsanalysen mit cDNS-Mikroarrays : Aufklärung der Pathogenesemechanismen einer seltenen Augenkrankheit Expressionprofiling using cDNA microarrays

Prietz, S. (2003). Expressionsanalysen mit cDNS-Mikroarrays: Aufklärung der Pathogenesemechanismen einer seltenen Augenkrankheit Expressionprofiling using cDNA microarrays. PhD Thesis, Freie Universität, Berlin.

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Fub-diss200375.zip (Any fulltext), 0B
 
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-
Name:
Fub-diss200375.zip
Description:
-
OA-Status:
Visibility:
Restricted (Max Planck Institute for Molecular Genetics, MBMG; )
MIME-Type / Checksum:
application/zip
Technical Metadata:
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-
Copyright Info:
eDoc_access: MPG
License:
-

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 Creators:
Prietz, Sandra1, Author
Affiliations:
1Max Planck Society, ou_persistent13              

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Free keywords: cDNA microarray expression profiling norrie
 Abstract: Zusammenfassung cDNS-Mikroarrays stellen ein modernes Verfahren zum Studium der Genexpression dar, die eine vergleichende Analyse des transkriptionellen Zustandes einer Zelle oder eines Gewebes ermöglichen. Tausende von Genen können dadurch simultan in ihrer Expressionsstärke erfasst werden. Gleichzeitig werden komplexe genetische Veränderungen besonders gut visualisiert. Die biologische Fragestellung dieser Arbeit war darauf ausgerichtet, Expressionsanalysen an limitiertem Ausgangsmaterial von Knockout-Mäusen mit einer seltenen Augenkrankheit durchzuführen. Dabei handelt es sich um die Norrie Krankheit, eine X-chromosomal-rezessive Erkrankung, die durch degenerative Veränderungen in der Netzhaut gekennzeichnet ist. Grundlage für die Expressionsanalysen stellte eine cDNS-Subtraktionsbank dar. Diese war insbesondere für gering exprimierte Gene angereichert, die in den Augen von Norrie-Knockout Mäusen fehlen oder auf einem sehr geringen Niveau exprimiert sind. Eine effektive Screening Methode ermöglichte die Mikroarray-basierte Charakterisierung von über 3000 cDNS-Klonen aus dieser Bank. Die Vielzahl an identifizierten Photorezeptor-spezifischen Genen wurde durch zusätzliche Augen-spezifische und Apoptose-relevante Gene aus einer Klon-Sammlung vervollständigt. Dadurch waren parallele Expressionsanalysen mit über 5000 Elementen möglich. Zur Hybridisierung mußten fluoreszent markierte Targets hergestellt werden, wobei die sehr geringen Mengen an RNS ? wie sie aus dem Auge einer Maus gewonnen werden können ? eine besondere Schwierigkeit darstellten. Methodisch völlig unterschiedliche Verfahren wurden verglichen und dahingehend beurteilt ob sie die initialen Transkript-Verhältnisse aufrechterhalten. In einer umfangreichen Studie wurde die zeitliche Änderung der Genexpression während der Krankheitsprogression der Norrie Krankheit erfaßt. Die Augen-RNS von jeweils drei Tierpaaren (ND-Knockout und Wildtyp) von sieben verschiedenen Altersstadien (0,5 bis 24 Monate) wurden jeweils mit zwei methodisch unterschiedlichen Techniken fluoreszenzmarkiert und auf die Mikroarrays hybridisiert. Die sehr umfangreichen Datensätze wurden durch Clusteranalyse ausgewertet, wodurch zeitliche Veränderungen der Genexpression identifiziert und visualisiert werden konnten. Dadurch war es erstmalig möglich, pathogenetische Prozesse der Krankheitsprogression in ND-Mäusen auf Transkript-Niveau zu analysieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die kontinuierliche Expression des ND-Gens eine wichtige Bedeutung für die funktionelle und strukturelle Integrität der retinalen Zell-Schichten, insbesondere für Photorezeptorzellen hat.

Details

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Language(s): deu - German
 Dates: 2003-04-11
 Publication Status: Accepted / In Press
 Pages: 130 S.
 Publishing info: Berlin : Freie Universität
 Table of Contents: 0.    Titel    0
1.   Zusammenfassung   1
2.   Einleitung   2
2.1.   Expressionsanalysen   2
2.2.   Die Technologie der cDNS-Mikroarrays   7
2.3.   Anwendungsmöglichkeiten der Mikroarray-Technologie   17
2.4.   Aufbau, Funktion und Erkrankung der menschlichen Netzhaut   19
2.5.   Fragestellung   24
3.   Material   25
3.1.   Biologisches Material   25
3.2.   Enzyme   29
3.3.   Kits   29
3.4.   Längenstandards, Vektor und Primer   30
3.5.   Fein- und Biochemikalien   31
3.6.   Lösungen und Puffer   33
3.7.   Verbrauchsmaterialien   36
3.8.   EDV-Programme   37
3.9.   Geräte   37
3.5.   Fein- und Biochemikalien   31
4.   Methoden   38
4.1.   Herstellung von cDNS-Mikroarrays   38
4.2.   Herstellung der Targets   41
4.3.   Hybridisierung und Waschen   51
4.4.   Bildgewinnung und Datenanalyse   53
4.5.   Clusteranalyse   54
5.   Ergebnisse   55
5.1.   Optimierung wesentlicher Schritte der cDNS-Mikroarray Technologie   55
5.2.   Vergleich von Nylon-Arrays mit Glas-Mikroarrays   62
5.3.   Charakterisierung von Subtraktionsbanken durch cDNS-Mikroarrays   65
5.4.   Optimierung für Expressionsanalysen mit limitiertem Augenmaterial   70
5.5.   Genexpressionsstudie in der ND-Knockout Maus   77
6.   Diskussion   85
6.1.   Optimierung wesentlicher Schritte der cDNS-Mikroarray Technologie   85
6.2.   Vergleich von cDNS-Mikroarrays mit Nylonfilter-Arrays als Screeningmethode   87
6.3.   Differenzielles Screening der Subtraktionsbank   88
6.4.   Optimierung für Expressionsanalysen mit limitiertem Augenmaterial   89
6.5.   Komplexität und Anreicherung der Targets   91
6.6.   Analyse der Genexpression in der ND-Knockout Maus   92
6.7.   Ausblick   98
7.   Literaturverzeichnis   100
8.   Abkürzungsverzeichnis   112
9.   Abbildungsverzeichnis   115
10.   Tabellenverzeichnis   116
11.   Anhang   117
11.1.   Haushaltsgene   117
11.2.   Retina-spezifische und Apoptose-relevante Gene   119
11.3.   Pools für das Redundanz-Screening und Anzahl detektierter Gene   120
11.4.   Hybridisierung vollständiger cDNS und Anzahl detektierter Gene   121
11.5.   Klone, die bestätigt differenziell exprimierte Gene repräsentieren   121
11.6.   Expressionsmuster der RNS-Targets im Zeitverlauf   122
11.7.   Expressionsmuster der SMART-Targets im Zeitverlauf   124
12.   Wissenschaftliche Beiträge   128
13.1.   Kongressbeiträge   128
13.2.   Publikationen   129
13.3.   Array-Kurse   129
13.   Danksagung   130
 Rev. Type: -
 Identifiers: eDoc: 194824
 Degree: PhD

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