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  Aufbau eines in vitro-Terminationssystems zur Funktionsanalyse von RRF

Vesper, O. (2003). Aufbau eines in vitro-Terminationssystems zur Funktionsanalyse von RRF. Diploma Thesis, Freie Universität, Berlin.

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Item Permalink: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-8B53-C Version Permalink: http://hdl.handle.net/11858/00-001M-0000-0010-8B54-A
Genre: Thesis

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:
Diplomarbeit Oliver Vesper Aprill 2003.pdf (Any fulltext), 10MB
 
File Permalink:
-
Name:
Diplomarbeit Oliver Vesper Aprill 2003.pdf
Description:
-
Visibility:
Restricted (Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin; )
MIME-Type / Checksum:
application/pdf
Technical Metadata:
Copyright Date:
-
Copyright Info:
eDoc_access: MPG
License:
-

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Creators

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 Creators:
Vesper, Oliver1, Author              
Affiliations:
1Ribosomes, Max Planck Institute for Molecular Genetics, Max Planck Society, ou_1433558              

Content

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Details

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Language(s): deu - German
 Dates: 2003
 Publication Status: Accepted / In Press
 Pages: -
 Publishing info: Berlin : Freie Universität
 Table of Contents: 0 ABKÜRZUNGEN  6
1 EINLEITUNG  8
1.1 PROTEINBIOSYNTHESE  8
1.2 STRUKTUR DES RIBOSOMS  8
1.3 ABLAUF DER PROTEINBIOSYNTHESE  11
1.3.1 Initiation  11
1.3.2 Elongation  12
1.3.3 Elongationsmodelle  12
1.3.3.1 Hybridstellen-Modell  12
1.3.3.2 α-ε-Modell  14
1.4 TERMINATION UND RECYCLING  16
1.5 ZIELSETZUNG  19
2 MATERIAL UND METHODEN  20
2.1 BEZUGSQUELLEN VON CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN  20
2.2 BAKTERIENSTÄMME UND PLASMIDE  22
2.2.1 Bakterienstämme  22
2.2.2 Plasmide  23
2.3 PUFFER, LÖSUNGEN UND MIKROBIOLOGISCHE MEDIEN  24
2.3.1 Gellösungen und Elektrophorhesepuffer  24
2.3.1.1 Agarosegele  24
2.3.1.2 Protein-SDS-Polyacrylamidgele  25
2.3.1.3 Polyacrylamidgel unter denaturierenden Bedingungen (RNA)  26
2.3.2 Pufferlösungen  26
2.3.2.1 Puffer für Plasmidisolierungen  26
2.3.2.2 Puffer für Ni-NTA Spin Kit  27
2.3.2.3 Puffer für molekulargenetische Methoden  28
2.3.2.4 Puffer für Watanabe-Assay  28
2.3.3 Mikrobiologische Medien  30
2.4 ANALYTISCHE METHODEN  30
2.4.1 Photometrische Konzentrationsbestimmungen  30
2.4.2 Radioaktivitätsmessung  31
2.4.3 Elektrophoresen  32
2.4.3.1 Agarose-Gelektrophorese  32
2.4.3.2 Protein-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese  32
2.4.3.3 Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (RNA-Gele)  34
2.5 MIKROBIOLOGISCHE UND MOLEKULARGENETISCHE METHODEN  35
2.5.1 Anzucht und Konservierung von E. coli  35
2.5.2 Herstellung von transformationskompetenten Zellen für die Elektroporation  36
2.5.3 Transformation mittels Elektroporation  36
2.5.4 Restriktionsverdau von DNA  37
2.5.5 Ligation von DNA-Fragmenten  38
2.5.6 Ligation und Transformation unter Verwendung des Topo® TA Kloning® Kit  39
2.5.7 Synthese von kurzen dsDNA-Fragmenten mittels Klenow-Reaktion  40
2.5.8 In vitro Transkription mittels T7-Polymerase  41
2.5.9 Polymerase-Kettenreaktion  42
2.5.10 Klonierung des RF3-Gens (prfC) aus E. coli XL1-Blue  43
2.5.10.1 Klonierungsstrategie  43
2.5.10.2 Primerauswahl  44
2.5.11 Überexpression des klonierten RF3-Gens in HB101 (RF3-pQE70Klon2)  45
2.6 PRÄPARATIVE METHODEN  45
2.6.1 Plasmidisolierung  45
2.6.2 Reinigung von DNA über Agarose-Gelelektrophorese und Gelextraktion  46
2.6.3 Phenol-Chloroform-Isoamyalkohol Extraktion  46
2.6.4 Ethanol-Präzipitation von DNA  47
2.6.5 Präparative Aufreinigung von mRNA aus Polyacrylamidgelen  47
2.6.6 Reinigung von His6-markierten Proteinen (Ni-NTA Spin Kit)  48
2.7 IN VITRO-SYSTEME  48
2.7.1 Watanabe Assay  48
2.8 COMPUTERGESTÜTZTE METHODEN  54
2.8.1 Sekundärstrukturanalyse von RNA  54
2.8.2 Sequenzvergleiche von Genen aus verschiedenen Organismen  54
3 ERGEBNISSE  55
3.1 KLONIERUNG VON RF3  55
3.1.1 Verschachtelte PCR: Amplifikation mit Taq-Polymerase und Klonierung in pQE-70  57
3.1.2 Amplifikation mit Taq-Polymerase und Ligation in pCRâII-Topoâ  58
3.1.3 Amplifikation mit Pwo-DNA-Polymerase, Klonierung in pCRâII-Topoâ und Subklonierung in pQE-70  59
3.2 IN VIVO KOMPLEMENTATION DES KÄLTE-SENSITIVEN STAMMES CL5 DURCH MUTRF3PQE70 UND RF3PQE70  61
3.3. AMINOSÄUREVERGLEICH DER RF3-GENE VERSCHIEDENER ORGANISMEN  62
3.4 ÜBEREXPRESSION DES KLONIERTEN RF3-GENS  64
3.5 REINIGUNG DES HIS6-MARKIERTEN RF3 ÜBER NI2+-AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE  65
3.6 ENTWURF UND HERSTELLUNG HETEROPOLYMERER MRNAS  66
3.6.1 Entwurf und Optimierung der mRNA-Sequenzen  66
3.6.2 Klonierung der DNA-Konstrukte zur Synthese der mRNAs  69
3.6.3 T7 Transkription und Reinigung der mRNA  70
3.7 FUNKTIONSANALYSE DER MRNA: STELLENSPEZIFISCHE TRNA-BINDUNG (WATANABE ASSAY)  72
3.7.1 Watanabe Assay im Standard-System  73
3.7.2 Watanabe Assay als Funktionstest der MFStop-mRNA  74
3.7.2.1 Etablierung des Pi-Zustandes mit Formyl-Methionyl-tRNAfMet für MFStop-mRNA  75
3.7.2.2 Etablierung der drei funktionellen Zustände mit N-Acetyl-[14C]Phenylalanyl-tRNAPhe für MFStop-mRNA  76
4 DISKUSSION  78
4.1 KLONIERUNG VON RF3  78
4.2 ENTWURF UND HERSTELLUNG HETEROPOLYMERER MRNAS – SYNTHESE UND ISOLIERUNG VON MFSTOP- UND 8CODONSTOP-MRNA  80
4.3 FUNKTIONSANALYSE DER MRNAS  81
5 AUSBLICK  82
6 ZUSAMMENFASSUNG  83
7 REFERENZEN  84
8 DANKSAGUNG  90
 Rev. Method: -
 Identifiers: eDoc: 194838
 Degree: Diploma

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