English
 
Help Privacy Policy Disclaimer
  Advanced SearchBrowse

Item

ITEM ACTIONSEXPORT
  Untersuchung der Huntingtinaggregation in Säugetierzellen und Identifizierung von HIP1-interagierenden Proteinen Analysis of huntingtin aggregation in mammalian cells and identification of HIP1-interacting proteins

Wälter, S. (2002). Untersuchung der Huntingtinaggregation in Säugetierzellen und Identifizierung von HIP1-interagierenden Proteinen Analysis of huntingtin aggregation in mammalian cells and identification of HIP1-interacting proteins. PhD Thesis, Freie Universität Berlin, Berlin.

Item is

Files

show Files

Locators

show

Creators

show
hide
 Creators:
Wälter, Stephanie1, Author
Affiliations:
1Max Planck Society, ou_persistent13              

Content

show

Details

show
hide
Language(s): deu - German
 Dates: 2002-08-13
 Publication Status: Accepted / In Press
 Pages: -
 Publishing info: Berlin : Freie Universität Berlin
 Table of Contents: 1.    Einleitung   1
2.   Untersuchung der Aggregatbildung von HD Exon 1 Proteinen in Säugetierzellen   3
2.1   Ergebnisse   7
2.1.1   Herstellen von stabilen Zelllinien   7
2.1.2   Bestimmung der optimalen Doxycyclinkonzentration   8
2.1.3   Bestimmung der optimalen Induktionszeit   10
2.1.4   Die Expression von HD Exon 1 Proteinen mit langen Polyglutaminketten führt zur Bildung von ubiquitinierten Aggregaten
  11
2.1.5   Zeitabhängigkeit der Aggregatbildung   13
2.1.6   Die Expression von HD Exon 1 Proteinen mit langen Polyglutaminketten führt zur Bildung von perinuklearen Aggregaten
  14
2.1.7   Cytoplasmatische Aggregate colokalisieren mit dem Centrosom und führen zur zellulären Umverteilung von Vimentin
  15
2.1.8   Colokalisation des Proteasoms mit HD Exon 1 Aggregaten   17
2.1.9   Die Inhibierung des Proteasoms verstärkt die Aggregationsbildung   18
2.1.10   Rekrutierung des ER-Chaperons BiP/Grp78 in die perinuklearen Einschlußkörper
  20
2.1.11   Colokalisierung von TIA-1, 14-3-3e und a-Synuclein   22
2.1.12   Ultrastruktur der perinuklearen Einschlußkörper   24
2.1.13   Die Expression von mutierten Huntingtinproteinen ist toxisch für 293 Tet-Off Zellen
  27
2.2.   Diskussion   27
3.   Identifizierung und Charakterisierung von HIP1-interagierenden Proteinen
  37
3.1   Ergebnisse   37
3.1.1   Strukturanalyse von HIP1   37
3.1.2   Affinitätsreinigung von HIP1-interagierenden Proteinen   39
3.1.3   Identifizierung der HIP1-interagierenden Proteine durch Massenspektrometrie und Immunblotting
  39
3.1.4   HIP1 Fragmente, die DxF-Motive enthalten, assoziieren direkt mit der a-Adaptin "Appendage"-Domäne
  43
3.1.5   Die coiled-coil-bildende Domäne in HIP1 ist entscheidend für die Bindung an die schwere Kette von Clathrin
  45
3.1.6   HIP1 ist mit Clathrin-bedeckten Vesikeln assoziiert   46
3.1.7   Die Überexpression von HIP1 (218-604) in COS-1 Zellen induziert die Bildung von großen vesikelartigen Strukturen
  48
3.2   Diskussion   51
4.   Materialien und Methoden   57
4.1   Materialien   57
4.1.1   Bakterienstämme   57
4.1.2   Zelllinien   57
4.1.3   Plasmidvektoren   58
4.1.4   Medien und Puffer   60
4.1.5   Oligonukleotide   61
4.1.6   Antikörper   63
4.1.7   Enzyme, Proteine und DNA   64
4.1.8   Chemikalien und Säulenmaterialien   65
4.1.9   Kits   67
4.1.10   Laborausstattung, Geräte und Zubehör   67
4.2   Methoden   70
4.2.1   Grundlegende molekularbiologische Methoden   70
4.2.1.1   DNA-Plasmidpräparation mit Qiagen-Kits   70
4.2.1.2   DNA-Plasmidpräparation über CsCl-Gradient   71
4.2.1.3   Konzentrationsbestimmung der DNA   72
4.2.1.4   Restriktionsverdau von DNA   72
4.2.1.5   Dephosphorylierung von 5´-Phosphatgruppen   72
4.2.1.6   Aufreinigung von DNA-Fragmenten   73
4.2.1.7   DNA Agarose-Gelelektrophorese   73
4.2.1.8   Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen   74
4.2.1.9   Ligation von DNA-Fragmenten   74
4.2.1.10   Polymerase-Kettenreaktion (PCR)   75
4.2.1.11   DNA-Sequenzierung   75
4.2.1.12   Plasmidkonstruktionen   76
4.2.1.12.1   pTet-CMV-Hyg-CAG20, -CAG51 und -CAG83   76
4.2.1.12.2   HIP1-Plasmide   76
4.2.1.12.2.1   pTL1-HIP1 (218-604)   76
4.2.1.12.2.2   pGEX-HIP1 (218-604)   76
4.2.1.12.2.3   pGEX-6P-1-HIP1, pQE32-HIP1 und pTL1-HA3-HIP1 (1-1003), (1-604), (1-333), (1-217), (218-604) und (334-604)
  76
4.2.1.12.3   pGEX-a-Adaptin   77
4.2.1.12.4   pSE111 Helferplasmid für Proteinexpression   77
4.2.2   Grundlegende mikrobiologische Methoden   78
4.2.2.1   Herstellung elektrokompetenter Zellen   78
4.2.2.2   Transformation kompetenter Bakterien mittels Elektroporation   78
4.2.2.3   Kultivierung und Lagerung von transformierten Bakterien   79
4.2.3   Grundlegende proteinbiochemische Methoden   79
4.2.3.1   Expression von rekombinanten GST-Fusionsproteinen in E. coli   79
4.2.3.2   Reinigung von rekombinanten GST-Fusionsproteinen   80
4.2.3.3   Reinigung von rekombinanten His-Fusionsproteinen unter nativen Bedingungen
  80
4.2.3.4   Reinigung von rekombinanten His-Fusionsproteinen unter denaturierenden Bedingungen
  81
4.2.3.5   Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen   82
4.2.3.6   SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)   82
4.2.3.7   Coomassie-Färbung von SDS-Gelen   83
4.2.3.8   Western Blot   84
4.2.3.9   Filtertest   85
4.2.3.10   Proteinbindungstest und Peptidkompetitionsstudien   86
4.2.3.11   Protein Overlay-Assay   86
4.2.3.12   Aufreinigung von Clathrin-bedeckten Vesikeln   87
4.2.3.13   Immunmarkierung der Clathrin-bedeckten Vesikel für elektronenmikroskopische Untersuchungen
  87
4.2.4   Grundlegende zellbiologische Methoden   88
4.2.4.1   Auftauen von kryokonservierten Säugetierzellen   88
4.2.4.2   Kultivierung und Lagerung von Säugetierzellen   88
4.2.4.3   Trypsinieren von Säugetierzellen   89
4.2.4.4   Bestimmung der Zellkonzentration von kultivierten Säugetierzellen   89
4.2.4.5   Transfektion von Säugetierzellen   89
4.2.4.6   Herstellung der stabilen, induzierbaren Tet-Off Zellen   90
4.2.4.7   Herstellung von Zelllysaten   90
4.2.4.8   Vorbereitung von Zellpräparaten für die Immunfluoreszenzmikroskopie   91
4.2.4.9   Vorbereitung von Zellpräparaten für die Elektronenmikroskopie   92
4.2.4.10   Inhibierung des Proteasoms mit Lactacystin   93
4.2.4.11   Toxizitätstest   93
4.2.5   Grundlegende immunologische Methoden   93
4.2.5.1   Herstellung von polyklonalen Antikörpern   93
4.2.5.2   Affinitätsreinigung von polyklonalen Antikörpern   94
4.2.5.3   IgG-Präparation aus Antiserum   94
4.2.6   Massenspektrometrie   95
4.2.6.1   Aufbereitung der Gelprobe   95
4.2.6.2   MALDI-TOF-MS Probenvorbereitung und Analyse   95
5.   Literaturverzeichnis   97
6.   EigenePublikationen   108
7.   Abkürzungen   109
8.   Danksagung   112
9.   Zusammenfassung   113
10.   Abstract   115
 Rev. Type: -
 Identifiers: eDoc: 30255
 Degree: PhD

Event

show

Legal Case

show

Project information

show

Source

show