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キーワード:
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要旨:
Zielsetzung
Die Vermehrung von Influenza-Viren zur Impfstoffherstellung erfolgt traditionell in Hühnereiern. Seit einigen Jahren gewinnt auch die Herstellung mittels Säugerzellkulturen in Bioreaktoren an Bedeutung. Beide Systeme resultieren in stark mit Protein und DNA verunreinigten Ernten sowie geringen Produktkonzentrationen. Eine Aufkonzentrierung der Virionen um einen Faktor von 20 bis 50 ist daher zwingend erforderlich. Diese wurde in der Vergangenheit z.B. durch Zentrifugation, Fällung oder Ultrafiltration erreicht. In dieser Studie wurde die Eignung von Ionenaustauscher-Membranen als Alternative zu den etablierten Verfahren untersucht.
Methoden
Humaner Influenza Virus A/PR/8/34 (H1N1) wurde in Rollerflaschen mit MDCK-Zellen vermehrt. Für die Kultivierung wurde ein serumfreies Medium verwendet. Der Kulturüberstand wurde mit einer Kombination aus Tiefen- und Membranfiltern geklärt und der Virus mit b-Propiolakton chemisch inaktiviert. Für die Versuche wurden Sartobind Q und D Ionenaustauscher-Module (Sartorius AG) mit 15 Membranlagen direkt mit der geklärten Kulturbrühe beladen. Die Elution des Virus erfolgte durch Anhebung der Ionenstärke mit NaCl oder Senkung des pH-Werts. Der Virus wurde über seine Hämagglutinierungs-Aktivität quantifiziert. Zusätzlich wurden der Proteingehalt und die DNA-Konzentration gemessen. Zur Online-Detektion des Virus wurde ein Streulichtdetektor eingesetzt. Die Kapazität der Ionentauscher wurde regelmäßig mit BSA überprüft.
Ergebnisse
Beide Ionenaustauscher waren geeignet, das Virus direkt aus der Brühe zu adsorbieren. Die Elution des Virus war jedoch nur durch eine Anhebung der Ionenstärke zu bewirken. Die Elution erfolgte dabei über einen weiten Bereich der Salzkonzentration (ca 0,3 bis 1 M NaCl). Die Senkung des pH-Wertes auf bis zu pH 3 führte hingegen zu einer irreversiblen Schädigung des Virus. Die Ausbeuten mit Sartobind Q lagen zwischen 70% und 90%. Die Ausbeuten mit Sartobind D betrugen lediglich 30% bis 50%. Die dynamische Kapazität der Sartobind Q Membranen wurde auf ca. 2 ml Brühe pro cm2 Membran bestimmt. Die Kapazität war nahezu unabhängig vom pH-Wert der Brühe. Die maximal erreichbare Aufkonzentrierung betrug Faktor 9 bei optimaler Fraktionierung. Das Gesamtprotein wurde auf ein fünftel der ursprünglichen Menge abgereichert. Die DNA blieb hingegen quantitativ erhalten. Es wurde eine Produktivität von 60 L m2 h-1 erreicht.
