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Abstract:
DieWeiterentwicklung minimal-invasiver chirurgischer Eingriffe, räumlich aufgelöster Massenspektrometrie und von ioanalysen mit hohem Durchsatz, bedürfen neuartiger Methoden um Gewebe zu schneiden und zur Extraktion von biologischen Molekülen ohne Veränderung der molekularen Struktur. In dieser Arbeit wird ein lasergestützer Ablationsprozess verwandt, der in der Lage ist präzise Gewebeschnitte mit minimalem Kollateralschaden auszuführen und außerdem biologische Komplexe unter Erhalt der biologischen Funktionalität aus dem Gewebe extrahiert. Die Methode basiert auf dem erst kürzlich entwickelten Picosekunden Infrarotlaser (PIRL). Dieser ist speziell dazu entwickelt worden um selektiv die Vibrationsmoden vonWasser anzuregen und dabei die Bedingung von ultraschneller Desorption durch stoßartige Vibrationsanregung (DIVE) zu erfüllen. Die grundlegende Funktionsweise ist, dass die selektiv angeregten Wassermoleküle als Treibmittel dienen um ganze biologische Strukturen aus der Oberfläche herauszulösen. Der Extraktionsprozess verläuft dabei schneller als alle thermischen schädlichen Effekte oder Fragmentation welche die Eigenschaften der Moleküle verändern würden. Die Ablation unter der DIVE Bedingung wird erstmals auf sechs verschiedene Gewebe des Auges angewandt und erzielt dabei präzise, gut kontrollierbare, reproduzierbare und minimal-invasive Schnitte. Unter anderem konnte die berührungslose und aplanationsfreie Hornhauttrepanation gezeigt werden. Massenspektrometrie und andere analytische Methoden zeigen, dass eine große Anzahl von Proteinen unterschiedlichster molekularer Massen durch die PIRL Ablation aus dem Gewebe extrahiert wird und dass diese Proteine in der Ablationswolke weder durch Fragmentation noch durch andere chemische Prozesse verändert sind. Mit unterschiedlichten Mikroskopie- und biochemischen Analysemethoden wird gezeigt, dass nanoskalige Einzelmolekülproteine, Viren und Zellen in der Ablationswolke morphologisch und funktional identisch mit ihren Kontrollproben sind. Die PIRL Ablation eröffnet neueWege für die Laserbehandlung in der Ophtamologie und kann dazu verwendet werden die chemische Aktivität in situ und in vivo zu erfassen. Das wichtigste Ergebnis ist die zerstörungsfreie Extraktion von biologischen Komplexen, was eine räumliche kompositorische Rekonstruktion ermöglicht, die nur durch die Größe des Laserfokusses begrenzt ist. Dies bietet enorme Entwicklungsmöglichkeiten für schnelle Hochdurchsatz-Biodiagnosen.
Abstract:
The prospects for minimally invasive surgery, spatial imaging with mass spectrometry and rapid high throughput biodiagnosis require new means of tissue incision and biomolecule extraction with conserved molecular structure. Towards this aim, a laser ablation process is utilized in this dissertation, which is capable of performing precise tissue incision with minimal collateral damage and extracting intact biological entities with conserved biological functions. The method is based on the recently developed Picosecond Infrared Laser (PIRL) designed to excite selectively the water vibrational modes under the condition of ultrafast Desorption by Impulsive Vibrational Excitation (DIVE). The basic concept is that the selectively excited water molecules act as propellant to ablate whole biological complexes into the plume, faster than any thermal deleterious effect or fragmentation that would mask molecular identities. The PIRL ablation under DIVE condition is applied for the first time to six types of ocular tissues, rendering precise and minimally invasive incisions in a well-controlled and reproducible way. An eminent demonstration is the contact-free and applanation-free corneal trephination with the PIRL. Mass spectrometry and other analytical techniques show that great abundance of proteins with various molecular weights are extracted from the tissue by the PIRL ablation, and that fragmentation or other chemical alternation does not occur to the proteins in the ablation plume. With various microscope imaging and biochemical analysis methods, nano-scale single protein molecules, viruses and cells in the ablation plume are found to be morphologically and functionally identical to their corresponding controls. The PIRL ablation provides a new means to push the frontiers of laser surgery in ophthalmology and can be applied to resolve chemical activities in situ and in vivo. The most important finding is the conserved nature of the extracted biological entities, rendering compositional reconstruction possible at the spatial limit of the laser focus, which has conspicuous potential in advancing rapid highthroughput biodiagnosis.
