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Schlagwörter:
Amyloid
Aggregation
Infrared Spectroscopy
Protein
Ion Mobility-Mass Spectrometry
Zusammenfassung:
Proteins are one of the most important biomolecules and are involved in a vast number of vital processes inside living organisms. Their structure is closely related to their function and therefore protein misfolding can not only impede crucial biological processes but may also trigger a variety of human disorders such as Alzheimer ́s and Parkinson ́s disease or type II diabetes. The involved proteins assemble and undergo a characteristic transition from usually unordered conformations into mainly β-sheet rich, insoluble amyloid fibrils. Recent investigations, however, indicate that not the mature fibrils but rather transient, polydisperse and polymorph folded intermediates represent the toxic species in the afore-mentioned diseases. Thus, understanding key factors such as inter- and intramolecular interactions that stabilize the native protein structure or either manipulate or hinder the amyloid formation process is essential for future drug development.
Traditional condensed-phase methods are of limited use for the structural characterization of amyloid intermediates, because they only provide ensemble-averages rather than information on individual oligomeric states. In the last decade, ion mobility-mass spectrometry (IM-MS) has emerged as a powerful alternative to investigate amyloid forming systems. IM-MS separates ions not only based on mass-to-charge (m/z) but also on differences in size, shape and charge. More importantly, it can be combined with other orthogonal techniques such as gas-phase infrared (IR) spectroscopy, providing complementary and highly diagnostic information on inter- and intramolecular interactions of m/z- and shape- selected ions. As a result, this combination yields crucial insights on secondary- as well as tertiary-structural transitions of individual oligomeric states.
In this thesis, a variety of biomolecular assemblies, ranging from amino acids over peptides to proteins, have been studied using IM-MS with gas-phase IR spectroscopy. First, a novel hydrophobicity scale for amino acids has been developed that in contrast to previous scales now excludes entropic effects of the solvent and therefore more accurately represents the true nature of the side-chain hydrophobicity. In addition, the new scale can be readily extended for non-natural versions, as exemplarily shown for fluorinated amino acid analogues.
Subsequently, other effects crucial for peptide and protein folding, in particular charge-dipole interactions and backbone as well as side-chain hydrogen bonding have been studied on a helical model peptide. It is shown that the charge-dipole interaction is most critical for stabilizing the helical structure in the gas phase, while the deletion of a single hydrogen bond only marginally alters the fine structure.
Furthermore, it is demonstrated in how far the native structure of two prototypical helical and β-sheet-rich proteins can be maintained in the absence of solvent, and which influence charge has on protein folding in the gas phase. When the proteins are carefully transferred form buffered solution into the solvent-free environment of the gas phase, usually lowly-charged species with comparable sizes to the respective native-structure are observed. In addition, their gas-phase IR spectra show an incredible agreement with their condensed-phase Fourier-transform infrared (FT-IR) and circular dichroism (CD) spectra. Thus, this study unambiguously demonstrates that aspects of the native secondary- as well as tertiary-structure of medium-sized proteins can be preserved in the absence of solvent. When the charges on the protein, however, increase, the native fold is destabilized and the protein refolds into artificial, gas-phase helices. At very high charge states these helices then unravel to form string-like structures that are governed by Coulomb-repulsion and C5-hydrogen bonds. The formation of these string-like structures is independent of the initial protein conformation and therefore can be seen as a new and universal secondary-structure that all proteins can access at very high charge states in the gas phase.
Finally, for the first time secondary structural transitions for individual, transient and toxic amyloid intermediates formed by the two peptide sequences VEALYL and NFGAIL have been successfully identified. The data show, that oligomers with as little as four to nine subunits can already contain a significant amount of β-sheet structure. Thus, the characteristic transition from unordered to β-sheet structures already occurs very early in the assembly process of amyloidogenic peptides and proteins. These studies represent the first direct secondary structure analysis of individual amyloid intermediates and highlight the potential of MS-based techniques for the amyloid research.
Zusammenfassung:
Proteine gehören zu den wichtigsten Biomolekülen und sind an zahlreichen unerlässlichen Prozessen in lebenden Organismen beteiligt. Ihre räumliche Struktur ist eng mit ihrer Funktion verbunden, weshalb Proteinmissfaltungen nicht nur entscheidende biologische Prozesse behindern, sondern auch menschliche Funktionsstörungen wie zum Beispiel Alzheimer, Parkinson oder Typ-II-Diabetes auslösen können. Die beteiligten Proteine aggregieren und wandeln sich von meist ungeordneten Konformationen zu β-Faltblatt- reichen, unlöslichen Amyloid-Fibrillen um. Neuste Forschungen deuten jedoch an, dass nicht die vollentwickelten Fibrillen, sondern eher kurzlebige, polydisperse und polymorphe Oligomere die toxischen Spezies in den oben genannten Krankheiten darstellen. Demnach ist das Verständnis über Schlüsselfaktoren wie inter- und intramolekularen Wechselwirkungen, die die native Proteinstruktur stabilisieren sowie die Amyloidbildung beeinflussen oder gar verhindern, entscheidend für die zukünftige Wirkstoffentwicklung.
Traditionelle Methoden, die aus der kondensierten Phase bekannt sind, können nur bedingt für die strukturelle Charakterisierung amyloider Oligomere eingesetzt werden, da sie nur gemittelte Informationen eines Ensembles anstatt eines einzelnen Oligomerzustandes liefern. Im letzten Jahrzehnt hat sich Ionenmobilitäts-Massenspektrometrie (IM-MS) als eine bedeutende Alternative für die Untersuchung amyloidbildendender Systeme hervorgetan. Mittels IM-MS können Ionen nicht nur nach ihren Masse-zu-Ladung Verhältnis (m/z), sondern auch nach Unterschieden in Größe, Gestalt und Ladung, getrennt werden. Ferner kann IM-MS mit anderen Techniken wie Infrarot (IR) Spektroskopie in der Gasphase orthogonal gekoppelt werden, um komplementäre und hoch diagnostische Informationen über inter- und intramolekulare Wechselwirkungen von m/z- und größenselektierten Ionen zu erhalten. Diese Kombination ermöglicht es daher, wichtige Einblicke in Sekundär- als auch Tertiärstrukturübergänge für individuelle Oligomerzustände zu erhalten.
In dieser Arbeit wurden Biomolekülaggregate – von Aminosäuren über Peptide bis hin zu Proteinen – mittels IM-MS und IR-Spektroskopie in der Gasphase untersucht. Zunächst wurde eine neuartige Hydrophobizitätsskala für Aminosäuren entwickelt, die im Gegensatz zu vorherigen Skalen entropische Effekte des Lösungsmittels ausschließt und damit die wahre Natur der Seitenkettenhydrophobizität widerspiegelt. Zudem kann die neue Skala ohne Weiteres für nicht natürliche Derivate erweitert werden, wie dies beispielsweise für fluorierte Aminosäureanaloga gezeigt wurde.
Anschließend wurden anhand eines helikalen Modellpeptides weitere, für die Peptid- und Proteinfaltung entscheidende Effekte, insbesondere Ladungs-Dipol-Wechselwirkungen und Rückgrat- als auch Seitenketten-Wasserstoffbrückenbindungen, untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Ladungs-Dipol Wechselwirkung am wichtigsten für die Stabilisierung der helikalen Struktur in der Gasphase ist, während das Entfernen einer einzelnen Wasserstoffbrückenbindung die Feinstruktur nur geringfügig ändert.
Im nächsten Schritt wurde untersucht, inwieweit die native Struktur von zwei prototypischen helikalen und β-Faltblatt-reichen Proteinen in Abwesenheit des Lösungsmittels erhalten bleibt und welchen Einfluss die Ladung auf die Proteinfaltung in der Gasphase hat. Sobald Proteine unter milden Bedingungen aus gepufferter Lösung in die Gasphase überführt werden, können Spezies in niedrigen Ladungszuständen beobachtet werden, deren Form und Gestalt vergleichbar ist mit der jeweiligen nativen räumlichen Struktur in Lösung. Des Weiteren wird eine bemerkenswerte Übereinstimmung zwischen den IR-Spektren aus der Gasphase und den Fourier-Transform-Infrarot (FT-IR) Spektren als auch Zirkulardichroismus (CD) Spektren aus kondensierter Phase beobachtet. Damit verdeutlicht diese Studie, dass Aspekte der nativen Sekundär- als auch Tertiärstruktur von mittelgroßen Proteinen nach dem Transfer in die Gasphase bewahrt werden können. Steigt jedoch die Anzahl der Ladungen am Protein an, wird dessen native Faltung destabilisiert und folglich kommt es zu einer Umfaltung in artifizielle Helices. Bei sehr hohen Ladungszuständen entwinden sich selbst diese helikalen Strukturen, sodass letztlich gestreckte Konformationen vorliegen, die sich durch Coulombabstoßung und C5-Wasserstoffbrückenbindungen auszeichnen. Die Bildung gestreckter Strukturen ist unabhängig von der ursprünglichen Sekundärstruktur des Proteins und kann deshalb als eine neue universelle Sekundärstruktur angesehen werden, die jedes Protein bei sehr hohen Ladungszuständen in der Gasphase annimmt.
Abschließend konnten erstmalig Änderungen in den Sekundärstrukturen einzelner, kurzlebiger, amyloider Oligomere, die von den Peptidsequenzen VEALYL und NFGAIL gebildet werden, direkt nachverfolgt werden. Oligomere, die nur aus vier bis neun Untereinheiten bestehen, enthalten bereits einen signifikanten Anteil an β-Faltblattstrukturen. Demzufolge erfolgt der charakteristische Übergang von ungeordneten zu β-Faltblatt-reichen Strukturen bereits im frühen Stadium des Aggregationsprozesses amyloider Peptide und Proteine. Diese Studien repräsentieren die erste direkte Sekundärstrukturanalyse von individuellen amyloiden Oligomeren und verdeutlichen das Potential von MS-basierten Techniken im Bereich der Amyloidforschung.
