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Abstract:
Membrane proteins are associated with biological membranes and fulfill functions that are vital for all living organisms. They mediate many physiological processes and are therefore important targets for the development of new pharmaceutical drugs. Numerous biophysical approaches have been developed that address the elucidation of their three-dimensional structure upon isolation. In this context, detergents are important tools, because they can isolate and stabilize membrane proteins apart from their native host. In recent years there has been a growing interest in studying the structure and dynamics of isolated membrane protein complexes by native mass spectrometry (MS). This technique can provide information about the mass and composition of a membrane protein complex and allows one to study interactions with structurally relevant ligands, such as drugs, nucleotides, or lipids. Detergents that are suitable for native MS do not only require solution conditions appropriate for membrane protein isolation but also gas-phase properties that help to retain native protein structures and their non-covalent interactions in the vacuum of a MS instrument. However, detergent families that are currently available can facilitate either the isolation of membrane proteins or their analysis by native MS.
This thesis addresses the question, how one can optimize the molecular structure of a detergent family for membrane protein isolation and individual applications in native MS. With this regard, the utility of dendritic oligoglycerol detergents (OGDs) was evaluated, which have not yet been used in membrane protein research. For this purpose, a highly systematic OGD library was constructed by systematically changing the structure of these detergents. In order to prove their general utility for protein MS, mixtures between soluble proteins and OGDs were analyzed by native MS. Data obtained from the soluble protein ß-lactoglobulin (BLG) indicated that protein charge states can be manipulated by tuning the basicity of these detergents. A comparative study between BLG and the membrane protein OmpF revealed the validity of this design criterion and demonstrated for the first time the utility of OGDs for native MS of membrane proteins. Moreover, with a set of five different OGDs and four membrane proteins it was examined, how crucial aspects, such as membrane protein isolation, charge states, and the ability to detect binding with structurally relevant membrane lipids could be independently optimized by altering the OGDs’ molecular structure. Furthermore, these detergents enabled the easy MS analysis of a G protein-coupled receptor protein (GPCR), which is one of the most challenging and most important protein families in pharmacology.
The obtained results open new avenues for the future development of detergents that cover optimal properties for membrane protein isolation and native MS applications.
Abstract:
Membranproteine sind ein essentieller Bestandteil von biologischen Membranen. Sie tragen maßgeblich zur Regulierung von physiologischen Prozessen bei und bilden deshalb einen wichtigen Anhaltspunkt bei der Entwicklung von neuen Medikamenten. Verschiedene biophysikalische Methoden wurden entwickelt, um die dreidimensionale Struktur von Membranproteinen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang haben Detergenzien eine besondere Bedeutung, denn sie können dabei helfen Membranproteine unter Erhalt ihrer nativen Struktur zu isolieren. In den vergangenen Jahren wuchs das Interesse an der Strukturuntersuchung von isolierten Membranproteinen mittels nativer Massenspektrometrie (MS). Diese Technik liefert Informationen über Masse und Zusammensetzung von komplexen Membranproteinen und ermöglicht die Untersuchung von Wechselwirkungen zu wichtigen Liganden, wie z. B. Medikamenten, Nukleotiden oder Lipiden. Die in diesem Zusammenhang bisher untersuchten Detergenzien bieten entweder vorteilhafte Eigenschaften für die Isolierung von Membranproteinen oder für deren Untersuchungen mittels nativer MS.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Fragestellung adressiert, ob es möglich ist die molekulare Struktur von Detergenzien für beide Anwendungsgebiete zu optimieren. Dafür wurde erstmalig das Potential von dendritischen Oligoglycerol-Detergenzien (OGDs) evaluiert. Für diesen Zweck wurde eine Substanzbibliothek aufgebaut, indem einzelne Strukturparameter der OGDs systematisch variiert wurden. Um die generelle Anwendbarkeit von OGDs für die MS-Analyse von Proteinen zu evaluieren, wurden im nächsten Schritt Mischungen von löslichen Proteinen und OGDs mittels MS untersucht. Beobachtungen führten zu der Hypothese, dass sich Ladungszustände von Proteinen durch die Basizität der OGDs steuern lassen. Weiterführende Studien mit dem trimeren Membranprotein OmpF untermauerten diese Hypothese und bestätigten darüber hinaus die Anwendbarkeit von OGDs für die Analyse von Membranproteinen mittels nativer MS. In einer weiteren Studie wurde mit Hilfe von fünf verschiedenen OGDs und vier verschiedenen Membranproteinen gezeigt, wie sich durch Variationen in der OGD-Struktur wichtige Aspekte individuell steuern lassen, z. B. die Isolierung von Membran- proteinen, Ladungsreduktion und die Möglichkeit Komplexe zwischen Membranproteinen und Lipiden zu detektieren. Darüber hinaus ermöglichten OGDs die einfache MS-Analyse von einem G-Protein- gekoppelten Rezeptor, welche derzeit eine der am schwierigsten zu untersuchenden Proteinfamilien ist und dessen Struktur von außerordentlicher pharmakologischer Bedeutung ist.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, wie sich die molekulare Struktur von OGDs für die Isolierung von Membranproteinen und nativer MS-Anwendungen optimieren lässt. Darauf aufbauend lassen sich neue Detergenzien entwickeln, welche in Zukunft die Untersuchungen von Membranproteinen erleichtern können.
