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Schlagwörter:
Nukleotide
Zusammenfassung:
Adenosin-3´,5´-zyklisches Monophosphat (cAMP) ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff,
der die Aktivität vieler Proteine reguliert. Eine Gruppe dieser Proteine besitzt eine
konservierte Bindestelle für zyklische Nukleotide (CNBD). Ionenkanäle (HCN/CNG),
Nukleotidaustauschfaktoren (EPACs), Proteinkinasen (PKA/PKG) und Transkriptionsfaktoren (CAP) werden durch diese CNBD reguliert. Ich habe die Dynamik der CNBD, am
Beispiel der isolierten CNBD des zyklisch Nukleotid-gesteuerten Ionenkanals (mlCNGKanals) aus dem Bakterium Mezorhizobium loti, untersucht.
Zunächst habe ich die Kinetik der Ligandenbindung mit der „stopped flow“-Technik bzw. der
Blitzlichtphotolyse des neuen caged compound BCMACM-8-NBD-cAMP gemessen. Es
zeigte sich, dass die Assoziationsraten nicht diffusionslimitiert sind und für die beiden
Liganden cAMP und 8-NBD-cAMP bei circa 107
M-1
s
-1 liegen. Die R348A-Mutante der
CNBD besitzt eine ungefähr 350-fach niedrigere Affinität für 8-NBD-cAMP, was
interessanterweise ausschließlich auf die Dissoziationsrate zurückzuführen ist; die
Assoziationsrate bleibt durch den Aminosäureaustausch unverändert. Gemeinsam mit neusten
Erkenntnissen aus NMR-spektroskopischen Untersuchungen der CNBD deutet das an, dass
die ligandeninduzierte Strukturänderung einem „induced fit“-Mechanismus folgt, d. h. die
Strukturänderung eine Folge der Ligandenbindung ist.
Die Dynamik der CNBD, insbesondere der Sekundärstrukturelemente, wollte ich durch
zeitaufgelöste Abstandsänderungen messen. Intramolekulare Abstände ungepaarter
Elektronen können mit Hilfe der „double electron-electron resonance“-Methode bestimmt
werden. Um möglichst viele strukturelle Zwischenstufen auf dem Weg von der ligandenfreien
zur -gebundenen CNBD untersuchen zu können, sollte die CNBD zu verschiedenen
Zeitpunkten nachdem sie mit Ligand gemischt wurde, eingefroren werden. Dafür habe ich
eine „microsecond freeze-hyper quenching“-Anlage mit einem dynamischen Bereich von
80 µs bis etwa 20 ms gebaut. Ungepaarte Elektronen sollten durch site-directed spin labeling
in das Protein eingebaut werden. Das habe ich sowohl mit Hilfe der unnatürlichen
Aminosäure p-Acetylphenylalanin als auch über Cysteine versucht. Mit keiner der beiden
Strategien konnte eine ausreichende Menge markierten Proteins präpariert werden. Durch eine
Verbesserung des Markierungsprotokolls sollte es jedoch möglich sein, ausreichende Mengen
markierten Proteins herzustellen und die Dynamik der CNBD zu messen.
Zusammenfassung:
A number of different proteins are regulated by the second messenger 3'-5'-cyclic adenosine
monophosphate (cAMP). Some of these proteins harbor a conserved cyclic nucleotide-binding
domain (CNBD). Ion channels (CNG/HCN), nucleotide-exchange factors (EPACs), protein
kinases (PKA/PKG), and transcription factors (CAP) are regulated by a CNBD in their
activity. My aim was to study the dynamics of the CNBD of a cyclic nucleotide-gated ion
channel from the bacterium Mezorhizobium loti (mlCNG-channel).
First, I have investigated the kinetics of ligand binding using the stopped-flow technique as
well as flash photolysis of the novel caged compound BCMACM-8-NBD-cAMP. I can show
that the on-rate of ligand binding for cAMP and 8-NBD-cAMP is lower than the diffusion
limit. The low affinity mutant R348A is characterized by a 350-fold lower affinity towards
8-NBD-cAMP compared to the wild-type CNBD. In kinetic terms this is due to an increased
off-rate of the mutant, whereas the on-rate is similar to that of the wild-type. Taken together
with recent results from NMR spectroscopic studies of the CNBD, I conclude that structural
changes induced by ligand binding do follow the induced fit mechanism, i. e. structural
changes are a direct consequence of ligand binding.
However, to get a more detailed picture of the dynamics of secondary structure
rearrangements, I wanted to measure distance changes within the CNBD in a time-resolved
manner. Intramolecular distances of unpaired electrons are eventually measured by the double
electron-electron resonance (DEER) method. Even though the DEER method is a very slow
technique it can be applied to study fast relaxation process, if interstages are trapped. To
accomplish this I have built a microsecond freeze-hyper quenching device capable of freeze
quenching protein samples 80 µs to 20 ms after they have been mixed with a ligand. Unpaired
electrons were introduced in the protein by site directed-spin labeling. I have used the
unnatural amino acid p-acetylphenylalanin, in addition to the labeling of cysteines. Up to
now, only a single interspin distance could be obtained. Nevertheless, some further
improvements of the labeling protocols will enable us to study the dynamics of the CNBD
comprehensively.
