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Zusammenfassung:
Hyperpolarisationsaktivierte und zyklisch Nukleotid-gesteuerte (HCN-) Ionenkanäle bilden
eine Familie von Ionenkanälen mit ungewöhnlichen Eigenschaften. HCN-Kanäle werden
durch Hyperpolarisation des Membranpotenzials aktiviert und die Kanalaktivierung wird
durch die Bindung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) moduliert. Das Wechselspiel zwischen der spannunginduzierten Aktivierung und der Ligandenbindung ist äußerst
komplex: So verändert einerseits die Ligandenbindung die Spannungsabhängigkeit des Kanals und andererseits die spannungsabhängige Kanalaktivierung die Ligandenaffinität.
Dieses Wechselspiel wollte ich in meiner Arbeit genauer untersuchen. Mein Ziel war es,
Bindungsereignisse einzelner Moleküle mit fluoreszenzoptischen Methoden zu verfolgen.
Ich habe hierzu ein fluoreszenzierendes Analog zyklischer Nukleotide (Atto488cAMP) verwendet und dessen Bindungseigenschaften charakterisiert. An Plasmamembransheets habe ich mit TIRF-Mikroskopie die Atto488cAMP-Bindung an heterolog exprimierte HCN2-
Kanäle und an isolierte Bindestellen sowohl makroskopisch als auch auf Einzelmolekülebene untersucht. Die Auswertung der Einzelmoleküldaten war kompliziert, da es auch unspezifische Bindungsereignisse gab und das Signal-zu-Rauschverhältnis nur moderat war.
Anschließend erweiterte ich den Messaufbau, um an lebenden Zellen parallel Elektrophysiologie und TIRF-Mikroskopie durchführen zu können. Mit dem Aufbau habe ich makroskopische Fluoreszenzmessungen etabliert. Aufbauend auf diesen Ergebnissen können
nun die Bindungszeiten einzelner Ligandenmoleküle an HCN2-Kanälen bei vorgegebenen
Membranpotenzialen studiert werden.
Zusammenfassung:
Hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-gated (HCN) ion channels belong to a family of ion channels with unusual properties. HCN channels are activated upon hyperpolarization of the membrane potential and the channel activation is modulated upon binding
of cyclic adenosine monophosphate. The interplay between the voltage-induced activation
and ligand binding is extremely complex: on one hand ligand binding changes the voltage dependence of the channel and on the other hand, the voltage-dependent channel activation changes the binding affinity.
I wanted to investigate this interplay in more detail. My aim was to track binding of individual molecules by a fluorescence optical approach. For this I used a fluorescent analog of cyclic adenosine monophosphate (Atto488cAMP) and characterized its binding properties.
With plasma membrane sheets and TIRF-microscopy I examined Atto488cAMP binding of
heterologously expressed HCN2 channels as well as of a isolated binding sites both macroscopically and at a single-molecule level. The analysis of the single-molecule data was
complicated, as there were non-specific binding events, and as the signal-to-noise ratio was
only moderate.
I expanded the experimental set-up, in order to perform electrophysiology and TIRF microscopy at living cells in parallel. With this set-up I established macroscopic binding studies. Based on these results, the binding times of individual ligands at HCN2 channels can now be studied at diffenerent membrane potentials.
