非表示:
キーワード:
Laserdesorption , Ionisation , Infrarot , Matrix-unterstützte Laser-Desorption , Instrumentation , Holographie , Fotografisches Verfahren , Interferom
要旨:
Direct analysis of tissues and cells by mass spectrometry is an emerging approach in guided laser surgery, high-throughput clinical bio-diagnostics, and mass spectrometry imaging. Especially for the analysis of labile compounds such as large proteins and non-covalently bound complexes, a soft sampling technique which preserves the integrity of the analyte molecules is desirable. Infrared (IR) laser desorption is a promising method for soft material extraction as it provides high spatial resolution, requires minimal sample preparation, and can be easily coupled to purification and separation techniques such as liquid chromatography. A core limitation to be overcome is the relatively low ionization efficiency when compared to other techniques commonly used with mass spectrometry, such as matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) or electrospray ionization (ESI).
By using a picosecond infrared laser (PIRL) at 3µm wavelength, desorption by impulsive vibrational excitation (DIVE) establishes optimal ablation conditions. Depositing energy at a higher rate than it can be dissipated by mechanical relaxation leads to a maximal pressure buildup before material ejection ensues, and to less collateral material damage since dissipation channels corresponding to thermal as well as acoustic damage to the specimen are reduced. This leaves even large biomolecules intact for subsequent analysis.
Within the scope of this thesis, the ablation and ionization characteristics of PIRL-DIVE were investigated in two different scenarios: first, the material ejection at atmospheric pressure was characterized using time-resolved digital interference microscopy, a photographic technique which showed high contrast for otherwise transparent objects such as acoustic shocks and ejected water vapor. Different ablation regimes exhibiting varying amounts of liquid and vapor-phase material were identified, and droplet generation could be suppressed when smaller volumes of liquid were irradiated. This opened up possibilities to further investigate the role of droplet generation and desolvation in analyte ionization. Second, the suitability of PIRL-DIVE for mass spectrometry imaging was investigated in a custom-built time-of-flight mass analyzer. Substantial improvements in signal strength, stability, and reproducibility were achieved compared to previous IR laser desorption ionization studies performed under vacuum conditions. The influence of several parameters such as laser fluence, extraction voltage, and pH value of the sample solution was investigated. The sample preparation protocol had significant impact on the observed signal quality. The obtained results potentially pave the way towards high-resolution, high-sensitivity mass spectrometry imaging from frozen cryo-sections of tissues and cells using the DIVE process.
要旨:
Die direkte massenspektrometrische Analyse von Geweben und Zellen ist ein relativ neuer Ansatz in der computergestützten Laser-Chirurgie, in der klinischen Biodiagnostik und im Gebiet der massenspektrometrischen Bildgebung. Vor allem für die Analyse labiler Stoffe wie besonders großer Moleküle und nicht-kovalent gebundener Komplexe ist eine Untersuchungsmethode wünschenswert, welche die Integrität der Analytmoleküle bewahrt. Die Infrarot (IR) Laserdesorption ist eine vielversprechende Methode zur "weichen" Probenentnahme, die eine hohe räumliche Auflösung bei minimaler Probenvorbereitung bietet und sich leicht an Aufreinigungs- und Separationstechniken wie die Flüssigchromatographie koppeln lässt. Bisher limitierend ist die relativ niedrige Ionisationseffizienz im Vergleich mit anderen Massenspektrometrie-Methoden wie zum Beispiel der Matrix-unterstützten Laserdesorption und Ionisation (MALDI) und der Elektrospray Ionisation (ESI).
Optimale Ablationsbedingungen können durch die Nutzung eines Pikosekunden Infrarot Lasers (PIRL) mit einer Wellenlänge von 3µm erreicht werden, ein Verfahren welches auch Desorption by Impulsive Vibrational Excitation (DIVE) genannt wird. Wird die Energie schneller zugeführt als sie durch mechanische Relaxation abgebaut werden kann, wird ein maximaler Ablationsdruck erreicht und das umliegenden Gewebe weniger beansprucht, da sowohl thermische als auch akustische Dissipationskanäle, die zu Schäden an der Probe führen könnten, vermieden werden. Selbst große Biomoleküle bleiben so für die weitere Analyse intakt.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der PIRL Ablation und Ionisation in zwei unterschiedlichen Szenarien: Zunächst wurde der Materialausstoß unter Atmosphärendruck mittels zeitaufgelöster digitaler Interferenzmikroskopie charakterisiert, ein photographisches Verfahren mit welchem ein hoher Kontrast für ansonsten transparente Objekte wie Druckwellen und Wasserdampf erzielt werden konnte. Verschiedene Regimes der Materialablation wiesen unterschiedliche Verhältnisse von flüssigem zu gasförmigem Material auf, wobei die Tröpfchenbildung für die Ablation von mikroskopischen Flüssigkeitsvolumen vollständig unterdrückt werden konnte. Dies zeigte eine Möglichkeit zur weiteren Untersuchung der Rolle der Tröpfchenbildung und -desolvatisierung für die Ionisierung von Analytmolekülen auf. Des Weiteren wurde die Eignung von PIRL-DIVE für die massenspektrometrische Bildgebung untersucht. Dazu wurde ein Flugzeit-Massenspektrometer aufgebaut und charakterisiert und der Einfluss mehrerer Parameter wie der Laser-Fluenz, der Extraktionsspannung und des pH-Werts geprüft. Es konnte eine wesentliche Verbesserung der Signalstärke, -stabilität und -reproduzierbarkeit im Vergleich zu vorhergehenden Studien der IR Laserdesorption und Ionisation unter Vakuumbedingungen demonstriert werden. Zudem wurde gezeigt, dass besonders die Probenvorbereitung eine wichtige Rolle für die Signalqualität spielte. Die erzielten Ergebnisse ebnen potenziell den Weg für eine hochauflösende und hoch-sensible massenspektrometrische Bildgebung von gefrorenen Probenschnitten mittels DIVE.
