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Massspectrometry; Laser; Multi-photonionization; Native MS; SALDI
Abstract:
The advent of soft ionization techniques such as MALDI and ESI has facilitated the study of non-volatile and fragile molecules with high masses in the absence of fragmentation. Since then, mass spectrometry (MS) has become a vital tool in biochemical and medical research, and these methods have paved the way for new research fields such as proteomics. A central yet unanswered scientific question is identifying and investigating every type of protein and its location within a single cell. Recent technologies have targeted clusters of cells to analyze and investigate diseases such as cancer. However, an in-depth understanding of cancer can only be reached when all protein functions and the evolution of malfunctions in a single cell are investigated and understood. With more than a billion different protein species, this is a challenging task and the requirements for scientific instrumentation are demanding.
Although MALDI and ESI are the most frequently employed analytical methods due to their robustness and maintainability, they also pose severe challenges, especially during sample preparation. The present work investigates new soft ionization techniques, which operate close to in vivo conditions while requiring minimal sample preparation - a foundational step in single-cell proteomics. First, a novel water-based sample preparation protocols is developed. Subsequently, two laser systems are employed to desorb and ionize the biomolecules in a resonant or non-resonant regime, which defines how laser pulses interact with water. The first method is coined resonant infrared laser-based matrix-assisted laser desorption and ionization (resonant IR-MALDI), and the second non-resonant femtosecond laser desorption and ionization (non-resonant fs IR-LDI).
Resonant IR-MALDI is especially useful as this technique targets water as an intermediate energy carrier to extract biomolecules from their native environment. Rigorous samples preparation and other pre-experimental steps are obsolete as water can be found in all living organisms. The present results show that such an approach can successfully produce mass spectra of peptides and proteins embedded in frozen aqueous solutions. Several sample preparation techniques were developed, which greatly simplify the established preparation protocols for specimens investigated under cryogenic conditions. Most importantly, an sample preparation protocol is reproducible and can be conducted within a few minutes. With these achievements, the IR laser-based MS is more streamlined and accessible to a broader scientific community. In addition to highly reproducible sample preparation, superior sensitivity have been achieved using various ablation techniques. We have discovered that oversampling, rastering the specimen area with distances smaller than the laser diameter, greatly enhances the quality of the results, particularly when the step size is limited to a few micrometers. Ultimately, we can obtain a sensitivity of 200 fmol per laser shot, which is suitable for most biological and biochemical specimens, but with greatly reduced effort in sample preparation and access to in vivo conditions. In follow-up experiments glycerol was used as an additive to push the limit of detection leading ultimately to a sensitivity of 1 fmol per laser shot.
In the second project, non-resonant fs IR-LDI is used in the second project to detect peptides around 1 kDa by irradiating specimens deposited on different substrates. An important finding is that no surface modification is necessary to obtain high-quality analyte signals. A systematic study with temperature-dependent measurements reveals that a low water-analyte ratio is beneficial for the signal onset. Furthermore, an exceptional sensitivity of 25 amol and a mass limit of 2.5 kDa have been achieved. Finally, a vibrant fragmentation pattern for the investigated analytes have been observed, but those fragments show only a fraction of the intensity of the intact species. In this work, the developed method have shown that water targets can be detected without rigorous sample preparation or surface modification and that 2D imaging is possible for different specimens.
Abstract:
Das Aufkommen sogenannter weicher Ionisationstechniken wie der matrix-unterstützten Laser Desorption und Ionisierung und der Elektrosprayionisierung ermöglicht die Untersuchung nichtflüchtiger und fragiler Moleküle bei geringfügiger Fragmentierung. Seither ist die Massenspektrometrie (MS) zu einer unverzichtbaren analytischen Methodik in der biochemischen und medizinischen Forschung avanciert und hat neue Forschungsbereiche wie die Proteomik erschlossen. Eine zentrale, noch Frage in der Biochemie, ist die Identifizierung und Untersuchung aller Arten von Proteinen in einer einzelnen Zelle. Da mit den aktuellen Technologien im wesentlichen Zellcluster untersucht werden, bleibt die Frage, wie eine Veränderung auf der molekularen Ebene in einer einzelnen Zelle zu einer Krankheit wie Krebs führen kann, unbeantwortet. Ein tiefgreifendes Verständnis der Ursache einer Erkrankung kann jedoch lediglich erreicht werden, wenn alle Proteinfunktionen und die Entwicklung von Fehlfunktionen in einer einzelnen Zelle verstanden sind. Bei mehr als einer Milliarde Proteinspezies ist dies eine anspruchsvolle Aufgabe mit hohen Anforderungen an die wissenschaftlichen Apparaturen. Obwohl MALDI und ESI aufgrund ihrer Robustheit und Wartungsfreundlichkeit die am häufigsten eingesetzten analytische Methoden sind, stellt die Probenvorbereitung, die für diese Methoden notwendig ist, ein wesentliches Problem dar. Auch arbeiten diese Methoden nicht unter in vivo-Bedingungen und erfüllen somit nicht die Voraussetzungen, Proteine in ihrer natürlichen Umgebung in einer einzelnen Zelle zu untersuchen.
In diesem Projekt wurden Peptide und Proteine im Wasser und ohne weitere Additive massenspektrometrisch untersucht. Die Analyse von Biomolekülen aus ihrem nativen Milieu vereinfacht erheblich die Probenvorbereitung und ermöglicht am ehesten den Analyten in vivo abzubilden – ein grundlegender Schritt für die Proteomik einer einzelnen Zelle. Zu Beginn wurde ein neues Protokoll für biologische Proben, die in dünnen wässrigen Schichten eingebettet sind, vorgestellt. Anschliessend wurden Infrarot Pulse (resonante IR-(MA)LDI) verwendet, die mit Wasser resonant wechselwirken, um die Desorption und Ionisation hervorzurufen. Im zweiten Abschnitt werden nicht-resonate Femtosekunden Infrarot Pulse (nicht-resonante IR-LDI) verwendet, um primär eine Wechselwirkung mit dem Substrat auszunutzen und dadurch eine oberflächenunterstützte Desorption und Ionisation des Analyten zu erreichen. In beiden Abschnitten wurden Biomoleküle in einem Flugzeitmassenspektrometer untersucht.
Die resonante IR-(MA)LDI ist besonders praktisch, weil bei dieser Technik Wasser als Matrix verwendet wird, um Biomoleküle aus dem Probengemisch zu extrahieren. Da Wasser in allen lebenden Organismen vorkommt, sind aufwendige Probenvorbereitungen und andere Voruntersuchungen minimal. Es wurde ein Pikosekunden-Infrarotlaser (PIRL) verwendet, der auf eine Wellenlänge von 3 μm abgestimmt ist, wo Wasser einen hohen Absorptionskoeffizienten hat. Unsere Ergebnisse zeigen, dass infrarot basierte Massenspektrometrie erfolgreich Massenspektren von Peptiden und Proteinen erzeugt. Wir haben mehrere Probenvorbereitungen entwickelt, die die etablierten Probenvorbereitungsprotokolle unter kryogenen Bedingungen erheblich vereinfachen. Ein entscheidendes Merkmal unseres Probenvorbereitungsprotokolls ist die Reproduzierbarkeit und die Einfachheit der Durchführung, die nur wenige Minuten dauert. Mit diesen Errungenschaften ist die (Infrarot) Laser basierte Massenspektrometrie einer breiteren Gemeinschaft zugänglich. Neben reproduzierbaren Probenvorbereitung wurden unterschiedliche Ablationstechniken getestet und eine hohe Empfindlichkeit erreicht. Wir haben festgestellt, dass das Oversampling, d. h. die Rasterung des Probenbereichs in Abständen, die kleiner sind als der Laserdurchmesser, die Qualität der Ergebnisse erheblich verbessert, insbesondere wenn die Schrittweite auf wenige Mikrometer begrenzt ist. Schließlich erreichen wir eine Empfindlichkeit von 200 fmol pro Laserschuss, die für eine biologische oder biochemische Fragestellung ausreichend ist. In darauf folgenden Experimenten wurde Glycerol als Additive zur Steigerung der Empfindlichkeit verwendt was zu 1 fmol pro Laserschuss führte.
Im zweiten Abschnitt wurde nicht-resonante IR-LDI, die primär mit den Substraten wechselwirken, erforscht. Hierbei wurden Peptide in Wasser und ohne weitere Zusätze auf verschiedenen Substraten erfolgreich nachgewiesen. Eine zentrale Erkenntnis ist, dass keine Oberflächenmodifikation des Substrates erforderlich ist, um qualitativ hochwertige Analytsignale zu erhalten. Eine systematische Studie mit temperaturabhängigen Messungen zeigt, dass ein niedriges Analyt-Wasser-Verhältnis einen Vorteil für Analytsignale mit hoher Intensität darstellt. Weiterhin wurde eine außergewöhnlich hohe Empfindlichkeit von 25 amol und eine Massengrenze von 2.5 kDa erreicht. Schließlich beobachteten wir eine Vielzahl an Fragmenten, die jedoch eine geringere Signalintensität als der Molekülionenpeak aufwies. Die Methode kann daher auch für die Aufklärung von Strukturen genutzt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Analyse wässriger Proben ohne aufwändige Probenvorbereitung oder Oberflächenmodifikation bei verschiedenen Substraten und mit unterschiedlichen (Laser) Wellenlängen funktioniert.
