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ErbB; receptor; random insertion
Abstract:
In der vorliegenden Arbeit wurde ein GFP in die extrazelluläre Domäne vom ErbB1 willkürlich eingeführt. Dazu wurde eine Transposon-Reaktion durchgeführt. Die DNA wurde in Baktieren transformiert und die Kolonien mit Hilfe geeigneter Resistenzen selektiert, welche das GFP im Vektor pcDNA3-ErbB1 besaßen. Um zu erfahren, ob das GFP in die extrazelluläre Domäne des Rezpetors eingeführt wurde, wurden 301 Kolonien mit PCR überprüft. Es ergab sich, daß 47 der 301 Proben das GFP in der extrazellären Domäne besaßen. Nach der Sequenzierung eines Teiles der DNA wurde mit Hilfe des Proteinblast kontrolliert, ob sich der Rezeptor ErbB1 in der richtigen Reading Frame befindet. Bei 15 Proben war dies der Fall. Ein weiterer Schritt war nun die Bestimmung der Position des GFPs im ErbB1. Die Transfektion in verschiedenen Zelllinien ergab, daß drei Konstrukte eine stark fluoreszierende Membran aufwiesen. An diesen wurde kontrolliert, ob nach Ligandenbindung die Rezeptoren funktional waren. Das Konstrukt I12, wo das GFP an 241. Stelle der Aminosäuresequenz von ErbB1 eingefügt worden war, zeigte nicht bei allen einen aktivierten Rezeptor, nur in wenigen Fällen eine Ligandenbindung und eventuell eine GFP-Dimerisierung. Beim Konstrukt II4 mit dem GFP an 407. Stelle war eine Ligandenbindung zu erkennen, allerdings keine Aktivierung von ErbB1 in CHO-Zellen, doch wahrscheinlich in HeLa-Zellen. Beim Konstrukt II7 zeigte der Rezeptor sowohl Ligandenbindung als auch Aktivierung. Dort ist das GFP an der 646. Stelle der Aminosäuresequenz von ErbB1. Eine Übersicht befindet sich in Tabelle 4. Die erfolgreiche Einführung des GFPs in die extrazelluläre Domäne von ErbB1 kann nun zu weiteren Untersuchen hinsichtlich der Struktur und Funktionsbeziehungen des Rezeptors dienen.
