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Abstract

Zusammenfassung: Zur Identifizierung wichtiger Signalgene beim Schlaganfall im Mausmodell wurden Genexpressionsprofile mit Hilfe der Affymetrix-GeneChip-Technologie anfertigt und mir zu Beginn dieser Arbeit zur Verfügung gestellt. Diese wurden mit einer unabhängigen Methode, der quantitativen real-time PCR, validiert. Dazu wurde in Wildtypmäusen (C57 black six) ein sechzigminütiger Verschluss der Arteria cerebri media verursacht und die Genexpressionsstärke von differentiell exprimierten Genen zu vier verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Es wurden Expressionswerte der ipsilateralen Hemisphäre relativ zur kontralateralen Gehirnhälfte errechnet und diese Werte anschließend graphisch mit den zu validierenden Hybridisierungsdaten verglichen. Von den 150 untersuchten Genen konnten 96 (63%) angesichts ihrer im Trend gleichförmigen Hoch- bzw. Herunterregulierung sehr gut belegt werden. Weitere 34% wurden aufgrund des Abweichens eines Messpunktes vom gesamten Trend als relativ gut validiert beurteilt. Für 3% bzw. 4 Gene konnte auf keine Bestätigung der Hybridisierungsdaten geschlossen werden. Aus Reproduzierbarkeitsexperimenten ergab sich eine mittlere Abweichung der CT-Werte von ±0,9 bzw. ein Fold Change-Wert von ±1,87. Die Expression einzelner, ausgewählter Proteine, z.B. Mt2, Blnk, Ccl9, Hmgb1, Plaur und Tlr2 sollte immunohistochemisch überprüft werden. Dabei auftretende Schwierigkeiten konnten noch nicht vollständig gelöst werden. Hierzu gehört die schlechte Fixierung des Gewebes aufgrund der ungenügenden Postfixierung mit PFA bzw. mit einem Methanol/Aceton-Gemisch. Gewebeschnitte PFA-perfusionsfixierter Mäusehirne konnten jedoch eine verbesserte Fixierung vorweisen und zusätzlich eine Spezifitätserhöhung der immunohistochemischen Färbung von Ccl9 ermöglichen. Bei Mt2 und Blnk führte erst das Verwenden eines Mouse-On-Mouse-Kits zur Detektion des Antigens mit monoklonalen Mausantikörpern. Die zu erwartende Regulierung von Hmgb1 und Tlr2 konnte teilweise dargestellt werden. Eine Zuordnung der differentiell exprimierten Gene war nur zu den bereits bekannten Signalwegen der Entzündung, der Apoptose und Zelldifferenzierung möglich.