Abstract
The focus of a two-photon microscope is often degraded by inhomogeneities in the refractive index within biological specimens. In this dissertation it is shown for various specimens, even for living zebrafish, that the resolution and the fluorescence signal of a two-photon microscope can be substantially improved by using adaptive optics, i.e. wavefront correction based on coherence-gated wavefront sensing (CGWS). The advantage of using CGWS relies on the fact that the wavefront distortions are sensed by backscattered instead of fluorescent light. Thus, neither photodamage nor photobleaching occurs and wavefront distortions can be sensed up to several scattering lengths deep within the specimen. Fast wavefront correction can be realized, allowing the measurement of a wavefront in less than 1 microsecond with an accuracy of lambda/50, even in strongly scattering samples. Furthermore, CGWS is thoroughly investigated for all relevant parameters affecting the measurement process, such as coherence length, polarization of the light, density of scatterers, and coherence-gate position. A realistic model of CGWS shows that for all experimentally accessible parameters the speckle contrast is fully developed. Thus, the ensemble-averaged wavefront is the incoherent superposition of spherical wavelets that originate from scatterers located within the coherence volume and then propagate through specimen-induced distortions.
In biologischen Proben kann mit der Zwei-Photonen Mikroskopie sehr häufig nicht das beugungsbegrenzte Auflösungsvermögen erreicht werden, da Inhomogenitäten im Brechungsindex der Proben die Wellenfront verzerren. In dieser Doktorarbeit wird gezeigt, dass mit Hilfe der adaptiven Optik - in diesem Fall der auf „Coherence-Gated Wavefront Sensing“ (CGWS) basierenden Wellenfrontkorrektur - das Auflösungsvermögen und das Fluoreszenzsignal eines Zwei-Photonen Mikroskops in verschiedenen Proben, wie z.B. in lebenden Zebrafischen, erheblich gesteigert werden kann. Der Vorteil von CGWS ist, dass zurückgestreutes Licht an Stelle von Fluoreszenzlicht benutzt wird, um die Wellenfrontaberrationen zu bestimmen. So werden die Fluoreszenzfarbstoffe nicht geschädigt oder gebleicht und Aberrationen können bis zu einer Tiefe von mehreren Streulängen gemessen werden. Weiterhin kann die Wellenfront in weniger als 1 Mikrosekunde mit einer Genauigkeit von lambda/50 korrigiert werden, sogar in stark streuenden Proben. Ein weiterer Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Abhängigkeit der Wellenfrontmessung mit CGWS von der Kohärenzlänge, Polarisation des Lichts, Streudichte und Position des Kohärenzvolumens. Ein realistisches Model für CGWS zeigt, dass für alle experimentell möglichen Parameter der Speckle-Kontrast beim CGWS voll entwickelt ist. Daher kann die über Speckle gemittelte Wellenfront als die inkohärente Überlagerung von sphärischen Wellen, die vom Kohärenzvolumen ausgehen und durch die Probe verzerrt werden, interpretiert werden.
