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Abstract

A novel system mimicking the first steps of integrin-mediated cell spreading was developed and characterized, reconstituting the transmembrane protein integrin alphaII beta3 into giant unilamellar vesicles (GUVs). The method consisted of a detergent-mediated reconstitution of solubilized integrins into small proteoliposomes (0.1 - 0.2 µm in size) followed by electroswelling of a partially dried film of the same proteoliposomes. The reconstitution process was validated by analyzing protein incorporation and biological activity. Biological activity of integrin in GUVs was furthermore checked by adhesion tests onto biofunctionalized surface. The adhesion dynamics was studied experimentally and the results compared to theoretical predictions. The adhesion started with the spontaneous formation of several small (~200 nm) domains of tight adhesion, which grew and eventually fuse to form a ring-shaped adhesive patch at the border of the contact zone. This ring grew toward the center until it formed a uniformly adhering zone. Three distinct regimes were identified: For the first regime, the single adhesion zones were predicted to grow with R ~ t^5/8, which agreed well with our experimental data. Ring closure in the third regime was predicted to proceed with Ri ~ -t, which was also found in experiments.

In dieser Arbeit beschreiben wir zum erstmals ein experimentelles System, welches die ersten Schritte der Integrin-vermittelten Zelladhäsion nachahmt. Mit Hilfe einer zuvor in der Gruppe von P. Bassereau (Institut Curie, Paris) entwickelten Methode haben wir das transmembrane Protein Integrin alphaII beta3 in unilamellare Riesenvesikel rekonstituiert. Die Methode besteht aus einer Detergenz-vermittelten Rekonstitution in kleine Proteoliposomen (Durchmesser 0,1 -0,2 µm). Im Anschluß werden diese Riesenvesikel mittels Elektroformation aus einem teilweise getrockneten Film dieser Proteoliposome erzeugt. Konfokalmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die fluoreszenzmarkierten Proteine homogen in die Riesenvesikel eingebracht wurden. Die Funktionalität des Integrins wurde mit Hilfe eines ELISA-Tests (enzyme-linked immunosorbent assay) auf kleinen Vesikeln überprüft. Eine spezifische Wechselwirkung zwischen in kleine Vesikel eingebrachtes Integrin und RGD-funktionalisierten Quantum Dots wurde ebenfalls nachgewiesen (RGD ist ein bekannter Integrin-Ligand). Darüber hinaus belegte der Adhäsionstests auf mit RGD biofunktionalisierten Oberflächen, dass die Proteine ihre biologische Aktivität auch nach der Elektroformation bewahren. Im weiteren wurde die Adhäsionsdynamik der Integrin-funktionalisierten Riesenvesikel auf RGD-beschichteten Oberflächen experimentell untersucht Der Adh äsionsprozess kann in drei Sequenzen unterteilt werden, die experimentellen Daten der Sequenzen 1) und 3) wurden mit theoretischen Modellen verglichen. Es kann gezeigt werden, dass der Adhäsionsprozess in beiden Regimen durch die Diffusion der Liganden limitiert ist.