Abstract
Zebrafish are external fertilizers and release their gametes into the surrounding water. Yet, the freshwater environment with its low osmolarity poses a challenge for the gametes. Given these unique ion conditions, it seems likely that zebrafish sperm have evolved specialized ion channels that are adapted to the freshwater environment. However, very little is known about the sperm of freshwater fish.
Another field that is still poorly understood is that of proton channels. Proton channels are exceptional among ion channels. Since protons differ substantially from other ions in their properties, their permeation pathways are very different from those of other ion channels. Proton channels select protons against other ions that are up to a million-fold more abundant, and only a few have been identified so far.
In my PhD thesis, I characterized a novel proton channel that belongs to the HCN channel family and is found in zebrafish sperm (drHCNL1). Despite its overall similarity to classical HCN channels that conduct K+ and Na+, drHCNL1 is exquisitely selective for protons. Activated by hyperpolarization, it conducts protons into the cytosol under physiological conditions, whereas the only other known voltage-gated proton channel, Hv1, is activated by depolarization and expels protons from the cell. Remarkably, protons permeate through drHCNL1’s voltage-sensing domain, whereas the “classical” pore domain is non-functional. Crucial for this proton permeation pathway is a methionine residue, which interrupts the series of regularly spaced arginine residues in the S4 voltage sensor. DrHCNL1 forms a tetramer and thus contains four proton pores. In contrast to classical HCN channels, drHCNL1 is not modulated by cyclic nucleotides. Another ion channel in zebrafish sperm previously identified, drCNGK, is also insensitive to cyclic nucleotides and, instead, is controlled by intracellular pH. My results suggest that both channels are functionally related, and that protons rather than cyclic nucleotides serve as cellular messengers in zebrafish sperm. The primary function of HCN channels is to depolarize the cell after hyperpolarization. In freshwater that is extremely low in Na+, a channel conducting Na+ would hyperpolarize sperm even further. Through small modifications in two key functional domains, drHCNL1 has been transformed to a proton-selective channel and thus evolutionarily adapted to the freshwater environment so that the sperm’s ability to depolarize is conserved.
Zebrafische pflanzen sich durch externe Befruchtung fort und geben hierzu ihre Gameten in das umgebende Wasser ab. Die Süßwasserumgebung mit ihrer geringen Osmolarität stellt jedoch eine besondere Herausforderung für die Gameten dar. Angesichts dieser einzigartigen Ionenbedingungen scheint es wahrscheinlich, dass die Spermien des Zebrafisches spezialisierte Ionenkanäle entwickelt haben, die an die Süßwasserumgebung angepasst sind. Über die Spermien von Süßwasserfischen ist jedoch sehr wenig bekannt.
Ein weiteres Feld, das noch wenig verstanden ist, ist das der Protonenkanäle. Protonenkanäle sind unter den Ionenkanälen eine Besonderheit. Da sich Protonen in ihren Eigenschaften wesentlich von anderen Ionen unterscheiden, erfolgt ihre Permeation auf eine ganz andere Art und Weise als die von anderen Ionen. Protonenkanäle selektieren für Protonen gegen andere Ionen, die bis zu einer Million Mal häufiger vorkommen, und nur wenige wurden bisher identifiziert.
In meiner Doktorarbeit habe ich einen neuartigen Protonenkanal charakterisiert, der zur Familie der HCN-Kanäle gehört, und in den Spermien von Zebrafischen (drHCNL1) vorkommt. Trotz seiner prinzipiellen Ähnlichkeit mit klassischen HCN-Kanälen, die K+ und Na+ leiten, ist drHCNL1 ein äußerst selektiver Protonenkanal. Durch Hyperpolarisation aktiviert, leitet es Protonen in das Zytosol. Damit ist er das genaue Gegenteil des bisher einzigen anderen bekannten spannungsgesteuerten Protonenkanals Hv1, der durch Depolarisation aktiviert wird und die Protonen aus der Zelle ausstößt. Bemerkenswert ist, dass die Protonen durch die Spannungssensordomäne von drHCNL1 geleitet werden, während die Porendomäne nicht funktionsfähig ist. Entscheidend für diesen Protonen-Permeationsweg ist ein Methionin-Rest, der die Sequenz der regelmäßig angeordneten Arginin-Reste im S4-Spannungssensor unterbricht. DrHCNL1 bildet ein Tetramer und enthält somit vier Protonenporen. Im Gegensatz zu den klassischen HCN-Kanälen wird drHCNL1 nicht durch zyklische Nukleotide angesteuert. Ein weiterer, zuvor von Sylvia Fechner identifizierter Ionenkanal im Zebrafischsperma, drCNGK, ist ebenfalls unempfindlich gegenüber zyklischen Nukleotiden und wird stattdessen durch den intrazellulären pH-Wert gesteuert. Meine Ergebnisse deuten darauf hin, dass beide Kanäle eine enge funktionelle Beziehung haben und dass Protonen statt zyklischer Nukleotide als zelluläre Botenstoffe in Zebrafischspermien dienen. Eine Hauptfunktion der HCN-Kanäle ist die Depolarisation der Zelle nach der Hyperpolarisation. In Süßwasser, das einen extrem niedrigem Na+-Gehalt hat, würde ein Na+-leitender Kanal die Spermien nur weiter hyperpolarisieren. Durch kleine Modifikationen in zwei wichtigen funktionellen Domänen hat sich drHCNL1 in einen selektiven Protonenkanal verwandelt und damit evolutionär an die Süßwasserumgebung angepasst, so dass die Fähigkeit der Spermien zur Depolarisation erhalten bleibt.
